番茄青枯病菌拮抗細菌的篩選及鑒定

羅 坤，胡利鋒，劉開林，劉祥英，柏連陽

(1.湖南農業大學植物保護學院，湖南長沙410128;2.湖南農業科學院，湖南長沙410125)

番茄青枯病是由番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum)引起的，是一種典型的土傳病害，長期以來威脅著番茄的生產［1-2］。番茄青枯病的防治方法主要有抗病品種和化學防治，如農用硫酸鏈霉素、新植霉素等。番茄青枯病生物防治主要從土壤中或者植株中分離純化篩選拮抗菌［3-4］，與番茄青枯病菌有相同的生態位，用于防治青枯病前景廣闊［5-6］。筆者從番茄青枯病發病田塊中的無病植株根際土壤中篩選獲得拮抗細菌，鑒定了其分類地位，并通過盆栽試驗驗證了其防效，旨在為番茄青枯病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養基。NA培養基:蛋白胨5.0 g，牛肉膏3.0 g，酵母粉1.0 g，蔗糖/葡萄糖15.0 g，瓊脂粉15.0 g，蒸餾水1 000ml，pH 7.0。

1.1.2 供試菌株。番茄青枯菌ND1由湖南農業大學農藥研究所提供。

1.1.3 供試土樣。土樣樣品采集于湖南省張家界市高峰鄉，采集病田塊中的健康植株的根圍土壤。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌的分離、純化與保存。采用稀釋分離法。稱取10 g土樣，加入90 ml無菌水中，從濃度為1×10-5g/ml的菌液中吸取150 μl放入培養基中，涂板。涂布后的平板以30℃培養24 h后觀察，挑取單菌落進行劃線純化，并編號［7］。

1.2.2 拮抗菌的篩選。采用抑菌圈法。以番茄青枯菌ND1為指示菌，檢測細菌的拮抗效果。將待測菌接在含有青枯菌的NA平板中心，30℃下培養48 h后，觀察有無抑菌圈形成。

1.2.3 拮抗菌的鑒定。

1.2.3.1 細菌的培養性狀的觀察。按《細菌分類學》的細菌培養性狀方法進行培養性狀的觀察。

1.2.3.2 生理生化反應的測定。主要包括對拮抗菌進行氧化酶試驗、過氧化氫酶試驗、V-P試驗、產H2S等試驗。

1.2.3.3 細菌16S rDNA引物測序及分析。將篩選得到的拮抗細菌用通用引物16S rDNA進行測序。引物采用細菌16S rDNA通用引物27F和1492R，即27F:AGA GTT TGATCCTGG CTCAG和1492R:TACGGCTACCTTGTTACGACTT。反應程序:95℃變性5 min;94℃變性40 s，56℃復性40 s，72℃延伸90 s，32次循環;72℃延伸7min，4℃保存。再將PCR產物送交廣東深圳華大基因有限公司進行測序，將序列提交NCBI數據庫，應用Blast程序與數據庫中已有的細菌16S rDNA序列進行同源性比較分析。序列的比較及系統發育分析采用MEGA4.0軟件進行［8］。

1.2.4 拮抗菌88號菌株溫室防效測定。接種病原菌3 d后，采用接抗菌88菌株發酵液灌根處理，設發病對照(CK)及鏈霉素對照，每處理4次重復，每重復5株番茄苗。記錄14 d的發病情況，計算病情指數及相對防治效果。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌篩選結果 以番茄青枯菌ND1為供試菌，從高華鄉番茄土樣中分離純化得到的104株細菌。將各類菌株分別進行拮抗作用測定，篩選到對番茄青枯病菌拮抗活性菌株有6株，占總數的5.7%。其中，菌株24號、菌株88號的抑菌半徑分別達6.3和7.2 mm，菌株38號、菌株39號、菌株54號和菌株102號的抑菌半徑相對較小，分別為2.5、2.7、1.2和2.3 mm(圖1)。

2.2 細菌種類初步鑒定 菌株88號的形態學特征、培養性狀在NA培養基上菌落生長慢，圓形、隆起、光滑、灰白色。在PDA培養基上菌落小，黃乳白色。在KB培養基上不產生熒光。G-，桿狀，極生鞭毛，未見芽孢。形成菌膜陰性，甲基紅陰性，VP試驗陰性，石蕊牛乳產堿，明膠液化陽性，產生H2S陰性，產生吲哚陽性，硝酸鹽還原陽性。根據《伯杰細菌鑒定手冊》(第九版，1994)所列的有關伯克氏屬形態學與生理生化形狀的描述初步認定拮抗細菌菌株88號屬于伯克氏屬(Burkholderia sp.)。

2.3 拮抗菌測序結果及分析 用16S rDNA通用引物，以菌株88的DNA為模板，經PCR反應擴增出1條約1 600 bp特異性片段，并同GenBank中16S rDNA序列進行比對，序列與越南伯克氏菌(Burkholderia vietnamiensis)FJ577505.1序列同源性高達100%。運用MEGA3.0軟件建立系統發育樹(圖2)，從菌株88所構建的系統進化樹來看，它與許多越南伯克氏菌之間的進化距離相隔較近，與菌株88號的形態特征和生理生化指標測定的結果一致。

2.4 拮抗菌溫室防控效果 結果表明，菌株88號對番茄青枯病菌14 d的防治效果為96.4%，極顯著高于鏈霉素對照(表1)，拮抗菌88號具有較大的生防應用潛力。

3 討論

番茄青枯病作為番茄生產上的一種頑固的土傳性病害，不易防治［9］。而拮抗菌具有和病原菌相同生態位等顯著特點，利用生物防治青枯病前景廣闊。該試驗在利用前人研究的方法篩選出1株細菌88號，對番茄青枯菌有很強的拮抗作用。經研究鑒定，該細菌均屬于伯克氏屬，與通常研究發現的青枯菌拮抗菌多屬于芽孢桿菌屬、假單胞桿菌屬不同。分子鑒定結果顯示，88號菌株為越南伯克氏菌(Burkholderia vietnamiensis)。此外發現，菌株88號對番茄晚疫病也有很強的拮抗作用，因此在防治番茄土傳病害上具有很好的應用前景［10-11］。

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［5］李鵬，毛自朝，李琪彬，等.青枯勞爾氏菌潛在新寄主鑒定與青枯病防治策略的思考［J］.中國農學通報，2013，29(6):199-202.

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［11］韋中，胡潔，董月，等.基于菜粕有機肥篩選番茄青枯病高效生防菌的研究［J/OL］.南京農業大學學報，2015(2).http://www.cnki.net/kcms/detail/32.1148.S.20150112.1012.002.html.