氯通道在阿霉素誘導鼻咽癌細胞凋亡中的作用

劉 梅，羅 海，林嘉偉，魏 燕，李 媛，劉善文，孟 龍，鄒麗莉，朱林燕，王立偉，，陳麗新

（1．萍鄉市人民醫院藥學部，江西萍鄉 337055；2．湖南醫藥學院生理學教研室，湖南懷化 418000；3．暨南大學醫學院藥理學系、4．暨南大學國際學院、5．暨南大學醫學院生理學系，廣東廣州 510632）

氯通道在阿霉素誘導鼻咽癌細胞凋亡中的作用

劉 梅1，3，羅 海2，5，林嘉偉4，魏 燕5，李 媛3，劉善文3，孟 龍3，鄒麗莉5，朱林燕3，王立偉4，5，陳麗新3

（1．萍鄉市人民醫院藥學部，江西萍鄉 337055；2．湖南醫藥學院生理學教研室，湖南懷化 418000；3．暨南大學醫學院藥理學系、4．暨南大學國際學院、5．暨南大學醫學院生理學系，廣東廣州 510632）

中國圖書分類號：R329.25；R739.63；R979.14

摘要：目的 研究氯離子通道在阿霉素誘導的低分化鼻咽癌CNE-2Z細胞凋亡及凋亡性容積減小中的作用。方法 采用全細胞膜片鉗技術記錄氯電流，流式細胞術檢測細胞凋亡，活細胞圖像分析法檢測細胞容積變化。結果 （1）阿霉素誘導CNE-2Z細胞凋亡；（2）阿霉素誘導CNE-2Z細胞發生凋亡性容積減小，細胞外灌流阿霉素2 h，細胞容積減小約10%；（3）阿霉素可激活氯通道，產生一個有較明顯外向優勢的氯電流；（4）氯通道阻斷劑5-nitro-2-（3-phenylpropylami-no）-benzoate（NPPB）明顯抑制阿霉素誘導的凋亡性容積減小、細胞凋亡和氯電流。結論 阿霉素可通過激活氯通道而誘導細胞凋亡，氯通道在阿霉素誘導的鼻咽癌細胞凋亡中發揮重要作用。

關鍵詞：阿霉素；鼻咽腫瘤；氯通道；膜片鉗技術；凋亡；凋亡性容積減小

網絡出版時間：2015－8－10 14：37 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．014．html

羅 海（1980－），男，博士，講師，研究方向：細胞生理學，并列第一作者，Tel：0745-2382880，E-mail：h＿luo＠163．com；陳麗新（1955－），女，博士，教授，博士生導師，研究方向：分子藥理學，通訊作者，Tel：020-85228865，E-mail：chenlix-inw＠sohu．com；王立偉（1959－），男，博士，教授，博士生導師，研究方向：細胞生理學，通訊作者，Tel：020-85226565，E-mail：wangli-weic＠sohu．com

阿霉素（adriamycin，ADM）為蒽環類抗生素，抗瘤譜較廣，療效高，是臨床常用的抗腫瘤藥物。除白血病外，其對膀胱癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、甲狀腺癌、多發性骨髓瘤、乳腺癌、軟組織肉瘤以及侵蝕性淋巴瘤等都有療效［1］。阿霉素抗腫瘤作用機制包括誘導腫瘤細胞凋亡、抑制細胞周期以及使腫瘤細胞發生自噬等［2］。文獻報道，阿霉素可能通過影響Bcl-2／Bax［3］、JNK凋亡通路［3］、p53凋亡通路［4］以及激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）［5］等誘導細胞凋亡，但其確切機制仍未十分明了。細胞凋亡早期出現的細胞容積減小稱為凋亡性細胞皺縮（apoptotic volume decrease，AVD），是具有普遍性意義的細胞凋亡早期的標志性事件。我們實驗室前期研究表明，氯通道參與過氧化氫誘導的腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞凋亡［6］、紫杉醇［7］和丹參酮［8］誘導的低分化鼻咽癌CNE-2Z細胞的凋亡。這些結果提示多種抗腫瘤藥物都可能通過激活氯通道引起AVD，繼而誘導細胞發生凋亡，從而發揮其抗癌作用。

本研究旨在探討阿霉素是否通過激活細胞氯通道而誘導凋亡性細胞皺縮，從離子通道的角度來探討阿霉素誘導CNE-2Z細胞凋亡的作用機制。

1　材料與方法

1．1細胞培養 用含10%小牛血清、雙抗（1×105U·L－1青霉素與100 mg·L－1鏈霉素）的RPMI1640生長液，在37°C恒溫培養箱（5%CO2、飽和濕度）內常規培養低分化鼻咽癌細胞（CNE-2Z），每兩天傳代1次。實驗前取對數生長期的CNE-2Z細胞，用0．25%胰酶進行消化傳代，收集、重懸細胞，將細胞懸液接種于直徑22 mm的圓形玻片上，置入培養箱使細胞貼壁，待細胞貼壁1 h后進行實驗。

1．2主要試劑與藥品 鹽酸阿霉素固體粉末購于上海生工生物有限公司，用二甲基亞砜（DMSO）溶解，配制成濃度為2.5 mmol·L－1的儲存液，儲存在4℃冰箱中，使用前稀釋至終濃度。氯通道阻斷劑5-nitro-2-（3-phenylpropylamino）-benzoate（NPPB）購自Sigma公司，溶于dimethyl sulfoxide（DMSO）中，配成100 mmol·L－1的儲存液，工作濃度為100 μmol ·L－1。等滲灌流液組成（mmol·L－1）：10 HEPES，0.5 MgCl2，70 NaCl，140 D-mannitol，2 CaCl2，用冰點滲透壓計（Osmomat030，Gono2tec）調節溶液滲透壓至300 mOsmol·L－1，用Tris-base調節pH至7.4。

1．3細胞容積測量 將貼有細胞的玻片置于灌流槽內，在倒置相差顯微鏡（IX71，Olympus，日本）下選擇固定視野，用圖像分析軟件（Image-Pro Plus 6．3，Media Cybernetics，USA）控制數字式攝像機（RETIGA 4000R，QImaging，Canada），進行連續拍攝，每2 min拍攝一幅，直至2 h。拍攝的圖片用Scion Image圖像分析軟件（Scion Corporation）處理，測量細胞直徑與面積，用以下公式計算細胞容積（V）：V＝4／3×（直徑／2）3，并標準化細胞容積（Vst）：Vst＝（Vt／Vo）×100%（Vt：細胞的實際容積，Vo：藥物刺激前即等滲條件下（對照）的細胞平均容積）。實驗分為空白對照組（Iso）、阿霉素組（ADM，2.5 μmol·L－1）、氯通道阻斷劑NPPB組（100 μmol ·L－1）、阿霉素（2.5 μmol·L－1）＋NPPB（100 μmol·L－1）組。實驗環境溫度為室溫（20℃～24℃）。

1．4流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞種植于6孔板中，培養箱中培養12 h，按上述實驗分組進行處理。36 h后，收集細胞，用PBS沖洗，并用預冷的70%乙醇于－20℃固定30 min。PBS清洗并離心，加入propidium iodide（PI，50 mg·L－1），室溫避光染色15 min。用流式細胞儀（Coulter EPTCSXL-31240，Coulter，USA）進行分析。

1．5膜片鉗全細胞記錄技術 EPC-7膜片鉗放大器（List Electronic，Germany）用于記錄全細胞電流，CED1401（Cambridge，UK）用于數字化（采樣頻率3 kHz）電流和電壓信號。拉制的電極是硼硅酸鹽毛細玻璃管，其內徑為0.86 mm，外直徑為1.5 mm，內含細長絲，于垂直微電極拉制器（PB-7）上，分兩步拉制。將電極內液充灌至電極容積的1／3至2／3間，此時阻抗約為（5－10）MΩ。全細胞記錄模式構建完成后，開始記錄實驗數據。將細胞鉗制在氯離子的平衡電位（0 mV）。按指令電壓的順序（±40，0 和±80 mV）循環記錄氯電流變化。每一電位持續時間約200 ms，兩電位之間間隔4 s。形成全細胞記錄后，補償電容。灌流等滲液3 min后，加入阿霉素，連續觀察氯電流變化，待阿霉素激活氯電流達峰值，并平衡5 min后，灌流含氯通道阻斷劑與阿霉素的等滲液，觀察氯電流變化，直至電流抑制到最小值，并平穩3 min以上。實驗數據用EPC（CED，Cambridge，UK）軟件分析。實驗環境溫度為室溫（20℃～24℃）。

全細胞膜片鉗記錄所需電極內液組成（mmol· L－1）：1 EGTA［乙二醇-雙-（2-氨基乙醚）四乙酸］，1.2MgCl2，70N-methyl-D-glucaminechloride（NMDG-Cl），10 HEPES，140 D-mannitol和2 ATP，并用Tris-base調節pH至7.25。

1．6統計學處理 采用SPSS 12．0軟件對實驗數據進行統計與分析，數據用±s表示，采用方差分析（ANOVA）檢驗差異的顯著性。

2　結果

2．1氯通道阻斷劑抑制阿霉素誘導的鼻咽癌細胞凋亡 用流式細胞儀檢測阿霉素誘導的鼻咽癌細胞凋亡率。實驗結果顯示，不加任何藥物處理的空白對照組細胞，其凋亡率為（1.74±2.34）%（n＝3）（Fig 1A），而用2.5 μmol·L－1的阿霉素處理36 h的細胞，凋亡率增加至（23.56±3.45）%（n＝3，P＜0.01，vs control）（Fig 1C）。

為了探討氯通道在阿霉素誘導的鼻咽癌細胞凋亡中的作用，我們觀察了氯通道阻斷劑NPPB對阿霉素誘導的凋亡的影響。結果顯示，單純用NPPB （100 μmol·L－1）處理的細胞，凋亡率為（1.58± 1.35）%，與空白對照組相比，差異沒有顯著性（n＝3，P＞0.05，vs control）（Fig 1B）。NPPB（100 μmol· L－1）與阿霉素（2.5 μmol·L－1）共同處理細胞，CNE-2Z細胞凋亡率為（13.29±2.78）%，與阿霉素組凋亡率（23.56±3.45）%相比，差異有顯著性（n＝3，P＜0.01）（Fig 1D）。

Fig 1 Inhibition of adriamycin-induced apoptosis by chloride channel blocker NPPB in nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells

2．2氯通道阻斷劑抑制阿霉素誘導的鼻咽癌細胞凋亡性容積減小 細胞圖像分析結果顯示，等滲液

灌流細胞2 h，細胞容積及形態基本保持不變（Fig 2A）。而用含2.5 μmol·L－1阿霉素的等滲液灌流細胞10 min內，便可觀察到CNE-2Z細胞的凋亡性容積減小的發生，在連續觀察120 min的過程中，發現細胞體積逐漸減小，皺縮（Fig 2B）。而阿霉素和NPPB聯合作用120 min時的細胞體積并沒有減小（Fig 2C）。Fig 2D顯示了藥物作用前后120 min細胞容積變化百分率，阿霉素灌流120 min時細胞體積減小至（90.36±0.42）%（n＝21，P＜0.01），阿霉素和NPPB聯合作用組細胞體積為（102.83± 0.44）%（n＝27），與阿霉素組相比，差異有顯著性（P＜0.01）。單純用NPPB灌流細胞，細胞體積有所增大，120 min時為（104.05±0.65）%（n＝14）。實驗結果表明，氯通道阻斷劑NPPB可以明顯抑制阿霉素誘導的鼻咽癌細胞容積減小，提示阿霉素可能通過激活氯通道而誘導鼻咽癌細胞凋亡，早期發生的凋亡性容積減小。

Fig 2 Inhibition of adriamycin-induced apoptotic volume decrease by chloride channel blocker NPPB

2．3阿霉素激活的CNE-2Z細胞氯電流 為了進一步驗證阿霉素是否通過激活細胞氯通道而誘導細胞凋亡性容積減小，我們用全細胞膜片鉗技術記錄了阿霉素激活的CNE-2Z細胞氯電流。Fig 3A所示為阿霉素誘導的鼻咽癌細胞氯電流全程圖。在等滲條件下，可記錄到一個微弱且穩定的背景氯電流（Fig 3A、B）。胞外灌流阿霉素，可以明顯激活氯電流，該電流具有外向優勢，外向電流明顯大于內向電流，且未見明顯時間依賴性失活（Fig 3A、C）。該電流的翻轉電位為（－3.00±0.84）mV（n＝8），接近氯離子平衡電位。當鉗制電壓為±80 mV時，該電流的平均峰值高達（－31.67±2.38）pA／pF（－80 mV）、（49.41±3.23）pA／pF（＋80 mV）（n＝6，P＜0.01，vs Iso）（Fig 3E）。在阿霉素激活氯電流且達平穩的基礎上，加入氯通道阻斷劑NPPB（100 μmol ·L－1），氯電流迅速降低（Fig 3A、D）。其對外向電流的抑制率為（79.96±6.57）%（＋80 mV），對內向電流抑制率為（76.64±4.66）%（－80 mV）（n＝5，P＜0.01，vs ADM）（Fig 3E），對內外向電流間的抑制作用差異無統計學意義。以上實驗結果提示，氯通道在阿霉素誘導CNE-2Z細胞凋亡早期的過程中起重要作用。

在所有實驗中，用來配制NPPB的DMSO在灌流液中的終濃度低于1%（V／V），其對阿霉素誘導的細胞容積減小及激活的氯電流沒有影響，且24 h內無細胞毒性。

3　討論

細胞凋亡異常在腫瘤以及許多疾病的發生發展中起著重要的作用。細胞凋亡發生于生理以及病理狀態下對不同刺激的應答過程中，具有一系列生化和形態學特征，其伴隨著細胞進行性的體積縮小，以及線粒體細胞色素C釋放、caspase激活、核固縮、DNA片段化和凋亡小體的形成［9］等。其中早期細胞皺縮或凋亡性容積減小（AVD）是在等滲狀態下發生的細胞體積縮小，具有普遍的意義。研究表明［10］，AVD發生于細胞色素C釋放、caspase活化以及DNA斷裂之前，是細胞凋亡早期的標志性事件。鑒于AVD在細胞凋亡早期觸發機制中的關鍵性作用，深入探討AVD的發生、發展過程及其機制，對于揭示凋亡規律有重要意義。

AVD的發生被認為與細胞內K＋與Cl－濃度減小有關［11］。在凋亡早期，凋亡誘導劑激活鉀通道與氯通道，促使K＋與Cl－外流，并驅動水的外流，致使細胞體積減小發生AVD，進而誘發凋亡［6，12］。氯通道參與細胞的多種生理功能，如細胞增殖［13］、遷

移［14］、凋亡［6］、細胞溶血［15］，還可參與冰片引起的細胞體積減小過程［16］。我們前文報道，中藥丹參酮發揮抗腫瘤作用的機制可能是通過激活氯通道引起氯離子和水外流，誘導AVD發生，進而引起細胞凋亡［8］。阿霉素作為一種常用的抗腫瘤藥物，它是否也可能通過激活氯通道誘導AVD和細胞凋亡？目前國內外沒有相關報道。本實驗采用活細胞影像系統實時拍攝細胞圖像，分析細胞凋亡早期的細胞容積變化。實驗結果表明，在阿霉素作用的10 min內，便可觀察到CNE-2Z細胞凋亡性容積減小的發生；而在阿霉素繼續作用的2 h內，細胞容積持續減小。流式細胞術檢測到阿霉素誘導CNE-2Z細胞凋亡，氯通道阻斷劑NPPB可以完全阻抑CNE-2Z細胞凋亡性容積減小、明顯阻抑細胞凋亡，提示阿霉素可以激活CNE-2Z細胞氯通道，進而誘導細胞發生AVD和細胞凋亡。

Fig 3 Inhibition of adriamycin-activated chloride currents by chloride channel blocker NPPB

為了進一步驗證這個觀點，我們用膜片鉗法記錄CNE-2Z細胞阿霉素激活的全細胞電流，直接觀察阿霉素對氯通道的激活作用。結果顯示，細胞外灌流阿霉素可激活一個外向電流，該電流與氯離子跨細胞流動所產生的電流一致，其翻轉電位接近氯離子的平衡電位－0.9 mV（根據本實驗所用細胞外灌流液及電極內液配方計算而得），該電流可被氯通道阻斷劑NPPB抑制，由此推知該電流為氯通道所介導的氯電流。本實驗結果為阿霉素激活氯通道提供了直接的實驗證據。由于實驗用細胞內外液主要離子為Na＋、Cl－、Ca2＋，而在本實驗條件下計算出的Na＋、Ca2＋平衡電位均高于200 mV，因此該電流與上述兩種陽離子電流無關。

本實驗觀察了阿霉素對氯通道的作用，以及阻斷氯通道對阿霉素誘導凋亡和凋亡性容積減小作用的影響。結果表明，阿霉素可激活鼻咽癌細胞氯通道，氯通道阻斷劑NPPB可以明顯抑制阿霉素誘導的氯電流、拮抗阿霉素引起的細胞凋亡性容積減小和細胞凋亡，提示阿霉素可能通過激活氯通道誘導細胞凋亡，氯通道在阿霉素抗腫瘤機制中發揮重要作用。本實驗的完成，加深了我們對阿霉素抗癌機制的認識。

（致謝：本研究主要在暨南大學醫學院分子細胞學實驗室完成，感謝陳麗新教授、王立偉教授、朱林燕副教授提供優良的學習環境及實驗平臺。）

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Roles of chloride channels in apoptosis induced by adriamycin in nasopharyngeal carcinoma cells

LIU Mei1，3，LUO Hai2，5，LIN Jia-wei4，WEI Yan5，LI Yuan3，LIU Shan-wen3，MENG Long3，ZOU Li-li5，ZHU Lin-yan3，WANG Li-wei4，5，CHEN Li-xin3
（1．Dept of Pharmacy，Pingxiang People’s Hospital，Pingxiang Jiangxi 337055，China；2．Dept of Physiology，Hunan University of Medicine，Huaihua Hunan 418000，China；3．Dept of Pharmacology of Medical College，4．International School，5．Dept of Physiology of Medical College，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

Abstract：Aim To investigate the roles of chloride channels in the apoptosis and apoptotic volume de-crease（AVD）induced by adriamycin in nasopharyn-geal carcinoma CNE-2Z cells．Methods Apoptotic rates were detected by flow cytometry，and the volume changes were measured by the time-lapse live cell ima-ging technique．The patch clamp technique was used to record whole-cell chloride currents．Results Adria-mycin induced apoptosis of CNE-2Z cells．An early ap-optotic volume decrease was observed in the cell trea-ted with adriamycin．The cell volume was decreased by about 10%in 2 h．Adriamycin activated a chloride current which showed outward rectification．The chlo-ride channel blocker 5-nitro-2-（3-phenylpropylamino）-benzoate（NPPB）could inhibit the adriamycin-in-duced chloride currents，apoptosis and prevent cell shrinkage．Conclusions Our findings suggest that ad-riamycin causes cell apoptosis by activation of chloride channels．Chloride channels may be involved in the apoptosis and apoptotic volume decrease induced by adriamycin in CNE-2Z cells．

Key words：adriamycin；nasopharyngeal neoplasms；chloride channels；patch clamp technique；apoptosis；apoptotic volume decrease

作者簡介：劉 梅（1989－），女，碩士，藥師，研究方向：分子藥理學，Tel：0799-6881737，E-mail：minzhupixie＠sina．com；

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 81273539，81173064，81272223）；教育部博士點基金資助項目（No 201244 01110009）；廣州市科技計劃項目（No 2013J500015）；東莞市科技計劃項目（No 2011108102006）；湖南省教育廳資助科研項目（No 12B102）

收稿日期：2015－05－29，修回日期：2015－06－30

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）09－1249－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．014