大黃素激活AMPK、PPARγ對3T3-L1脂肪細胞葡萄糖攝取的影響

洪海棉，謝秀利，洪桂祝，賴文芳

（福建中醫藥大學藥學院，福建福州 350122）

大黃素激活AMPK、PPARγ對3T3-L1脂肪細胞葡萄糖攝取的影響

洪海棉，謝秀利，洪桂祝，賴文芳

（福建中醫藥大學藥學院，福建福州 350122）

中國圖書分類號：R-332；R284．1；R329．24；R343．23；R587．1

摘要：目的 研究大黃素對3T3-L1脂肪細胞葡萄糖攝取的影響，并探討其作用機制。方法 誘導分化成熟的3T3-L1脂肪細胞經LPS干預后分為Control組、大黃素給藥組（1、10、50 μmol·L－1），檢測6-NBDG攝取情況及GLUT4、PPARγ、AMPKα1／2、p-AMPKα1／2、IRS-1、p-IRS-1、Adiponec-tin、chREBP-α和chREBP-β的表達。用AMPK和PPARγ抑制劑分別干預后，檢測6-NBDG的攝取情況。同時，以STZ誘導大鼠2型糖尿病模型，分為Control組和大黃素給藥組，檢測大鼠內臟脂肪組織的Adiponectin的mRNA表達及GLUT4、AMPKα1／2、p-AMPKα1／2蛋白表達。結果 與Con-trol組相比，大黃素可促進GLUT4、Adiponectin、chREBP-α、chREBP-β的mRNA表達及GLUT4、PPARγ、IRS-1、p-IRS-1、AMPKα1／2和p-AMPKα1／2的蛋白表達（P＜0.05），可提高3T3-L1脂肪細胞對6-NBDG的攝取，經AMPK及PPARγ抑制劑分別干預后，大黃素對6-NBDG的攝取降低（P＜0.05）。同時，大黃素可促進T2DM大鼠內臟脂肪組織Adiponectin的mRNA表達及GLUT4、AMPKα1／2和p-AMPKα1／2的蛋白表達（P＜0.05）。結論 大黃素可促進3T3-L1脂肪細胞的葡萄糖攝取功能，其作用機制與激活Adiponectin及IRS-1，進而激活AMPK和PPARγ的信號通路有關。

關鍵詞：大黃素；2型糖尿病；葡萄糖攝取；3T3-L1細胞；葡萄糖轉運體4；AMPK；PPARγ

網絡出版時間：2015－10－16 9：52 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20151016．0952．036．html

大黃是蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatum L．、唐古特大黃Rheum tanguticum’Maxim．ex Balf．或藥用大黃Rheum officinale Baill．的干燥根和根莖，2010版中國藥典介紹大黃具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經、利濕退黃的功效。大黃素（emodin）是大黃的主要有效成分之一，有研究發現大黃素具有抗炎、降糖、降脂等作用，并能改善胰島素抵抗，具有治療2型糖尿病（type 2 diabetes melli-tus，T2DM）的潛在價值［1－3］。

葡萄糖轉運體4（glucose transporter type 4，GLUT4）是脂肪細胞和肌細胞攝取葡萄糖的重要轉運體［4］，并受AMP依賴的蛋白激酶［adenosine 5’-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK］和過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxi-some proliferator-activated receptor γ，PPARγ）的調控。激活AMPK或PPARγ均可促進細胞編碼GLUT4基因和GLUT4蛋白向細胞膜轉位，是治療T2DM的重要靶點［5－7］。課題組前期發現，大黃素對鏈脲佐菌素（STZ）誘導T2DM大鼠的胰島素有增敏作用，并明顯上調T2DM大鼠皮下脂肪組織細胞膜上GLUT4蛋白的表達［8］，但對其藥理作用的分子機制尚不明確。本研究進一步從AMPK和PPARγ途徑探討大黃素對脂肪細胞葡萄糖攝取的作用機制。

1　材料

1．1實驗動物與細胞株 ♂Wistar大鼠［上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2012－0002］，由福建中醫藥大學實驗動物中心飼養；小鼠3T3-L1成纖維細胞（中國科學院上海生命科學研究院）。

1．2藥品與試劑 大黃素（純度≥98%，陜西森弗生物技術有限公司，貨號：20111120006）；Rever-taid First Strand cDNA Synthesis Kit（美國Fermentas公司）；RNeasyMini Kit（德國Qiagen公司，貨號：74104）；6-NBDG（Sigma-Aldrich，貨號：72987）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術研究所）；GW9662（Sigma-Aldrich公司，貨號：M6191）；Compound C（Sigma-Aldrich公司，貨號：P5499）；抗體AMPKα1／2（Santa Cruz公司，貨號：sc-25792）、p-AMPKα1／2（Santa Cruz公司，貨號：sc-33524）、PPARγ（Santa Cruz公司，貨號：sc-7273）、GLUT4 （Santa Cruz公司，貨號：sc-7938）、IRS-1（Santa Cruz公司，貨號：sc-559）和p-IRS-1（Santa Cruz公司，貨號：sc-33956）；小鼠18S rRNA探針引物（貨號：4319413E，Applied Biosystems）。

1．3儀器 凝膠成像分析系統（Bio-Rad，型號：ChemiDoc XRS＋），PCR儀（Bio-Rad，型號：C1000），熒光定量PCR儀（Applied Biosystems，型號：7900HT），高速臺式冷凍離心機（Thermo Fisher，型號：Primo R）。

2　方法

2．1細胞誘導及處理方法 3T3-L1前脂肪細胞接種到24孔板中，培養于37℃、5%CO2培養箱中。用第1誘導液（10%胎牛血清和1%雙抗的高糖DMEM，0.5 mmol·L－1異丁基甲基黃嘌呤，1.0 mg ·L－1胰島素和1.0 μmol·L－1地塞米松）培養細胞48 h，更換為第2誘導液（10%胎牛血清和1%雙抗的高糖DMEM，1 mg·L－1胰島素）培養16 d，采用油紅O染色法染色觀察細胞內有油滴聚集，即表示3T3-L1細胞已誘導分化為成熟的脂肪細胞。經10 μg·L－1LPS干預24 h后，實驗分為Control組、Emodin給藥組（1、10、50 μmol·L－1），收集細胞檢測各項指標。同時，3T3-L1脂肪細胞經10 μg·L－1LPS干預24 h，分為Control組、Emodin組、GW9662 （5 μmol·L－1）＋Emodin組、Compound C（10 μmol ·L－1）＋Emodin組。各組加入20 μmol·L－1葡萄糖類似物6-NBDG培養30 min。吸去培養液，用PBS洗滌細胞3遍，加入含1%曲通X-100的0.1 mol·L－1pH 10磷酸鉀緩沖液70 μL，避光裂解細胞10 min后，加入30 μL DMSO，輕輕搖動，使其與裂解液充分混勻后，用激發波長466 nm和發射波長540 nm熒光檢測每孔熒光強度。

2．2動物造模及處理方法 STZ誘導T2DM模型的方法參照Lai等［9］的報道。♂Wistar大鼠（200± 20）g經適應性喂養后，改換高脂飼料飼養6周。經腹腔注射25 mg·kg－1STZ，4周后檢查大鼠空腹血糖（FBG）水平，FBG＞7.8 mmol·L－1的大鼠視為T2DM模型。實驗大鼠隨機分為Control組和大黃素給藥組，給藥組每天灌胃大黃素100 mg·kg－1，Control組灌胃等體積的0.5%Na-CMC，連續灌胃21 d，并觀察大鼠每天的體重變化和進食情況。d 21取內臟脂肪組織進行后續實驗。

2．3Real-time PCR檢測mRNA的表達 按照QIAGEN RNeasyMini Kit試劑盒的操作步驟提取動物組織或細胞總RNA，用Revertaid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進行逆轉錄為cDNA。PCR反應以cDNA為模板，反應條件為50℃2 min，95℃預變性15 s，退火60℃30 s，40個循環。每個實驗重復處理3批樣品，每批樣品分別以同一批樣品的內參計算ΔΔCt，以2－ΔΔCt計算各組mRNA的表達量。ΔΔCt＝各組（Ct目的基因－Ct內參）－對照組（Ct目的基因－Ct內參）。PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司參照GenBank合成。引物序列詳見Tab 1。

Tab 1 Sequences of primers for Real-time PCR

2．4Western blot法檢測蛋白的表達 用含1% PMSF的RIPA裂解液裂解動物組織或細胞，離心取上清液，用BCA法檢測蛋白濃度，加1×上樣緩沖液，100℃變性10 min。用SDS-PAGE凝膠進行電泳、轉膜、封閉、4℃孵育一抗過夜，TBST洗膜3遍后，孵育二抗2 h，用Bio-Rad凝膠成像系統進行ECL顯影。

2．5統計學處理 實驗數據用SPSS 20．0軟件進行統計分析，所有結果以±s表示，組間比較采用Student-t檢驗或one-way ANOVA進行統計。

3　結果

3．1油紅O染色觀察誘導分化的3T3-L1脂肪細胞 誘導分化后的3T3-L1細胞，體積變大，多呈圓形，胞質內容豐富，用油紅O染色可見紅色脂滴富集細胞核周（Fig 1）。表明3T3-L1脂肪細胞已經誘導分化成熟。

Fig 1 Differentiated 3T3-L1 adipocytes strained by oil red O（scale bar＝50 μm）

3．2大黃素對3T3-L1脂肪細胞的細胞膜GLUT4

及細胞攝取6-NBDG的影響 與Control組相比，大黃素給藥組明顯提高3T3-L1脂肪細胞對6-NBDG的攝取，并提高細胞膜上GLUT4的mRNA及蛋白表達水平，且差異有顯著性（P＜0.05）（Fig 2）。

Fig 2 Emodin enhanced 6-NBDG uptake（A）and mRNA（B）and protein（C）expression of cell surface GLUT4 in 3T3-L1 adipocytes（n＝3）

3．3大黃素對3T3-L1脂肪細胞Adiponectin、chREBP-α和chREBP-β的mRNA表達及IRS-1、p-IRS-1蛋白表達的影響 與Control組相比，大黃素給藥組可提高3T3-L1脂肪細胞Adiponectin、chREBP-α和chREBP-β的mRNA表達（P＜0.05）。同時，大黃素給藥組也提高了3T3-L1細胞IRS-1蛋白磷酸化水平，且差異有顯著性（P＜0.05），見Fig 3。

3．4大黃素對3T3-L1脂肪細胞AMPKα1／2、p-AMPKα1／2蛋白表達的影響，及經AMPK抑制劑作用后對6-NBDG攝取的影響 與Control組相比，大黃素給藥組可提高3T3-L1脂肪細胞AMPKα1／2蛋白磷酸化水平，且差異有顯著性（P＜0.05）。同時，與Control組相比，大黃素給藥組可提高3T3-L1脂肪細胞對6-NBDG的攝取。與Emodin組相比，Compound C組降低細胞對6-NBDG的攝取，而Com-pound C＋Emodin組3T3-L1脂肪細胞對6-NBDG的攝取也降低（P＜0.05），見Fig 4。

3．5大黃素對3T3-L1脂肪細胞PPARγ蛋白表達的影響，及經PPARγ抑制劑作用后對6-NBDG攝取的影響 與Control組相比，大黃素給藥組可提高3T3-L1脂肪細胞PPARγ蛋白表達水平，且差異有顯著性（P＜0.05）。同時，與Control組相比，大黃素給藥組可提高3T3-L1脂肪細胞對6-NBDG的攝取。與Emodin組相比，GW9662組降低細胞對6-NBDG的攝取，而GW9662＋Emodin組3T3-L1脂肪細胞對6-NBDG的攝取也降低（P＜0.05），見Fig 5。

3．6大黃素對T2DM大鼠脂肪組織細胞膜GLUT4蛋白及Adiponectin的mRNA表達的影響與Control組相比，Emodin組可提高T2DM大鼠脂肪組織細胞膜上GLUT4的蛋白表達和Adiponectin 的mRNA表達，且差異有顯著性（P＜0.01），見Fig 6。

3．7大黃素對T2DM大鼠脂肪組織AMPKα1／2、p-AMPKα1／2的蛋白表達的影響 與Control組相比，Emodin組可提高T2DM大鼠的AMPKα1／2的蛋白磷酸化水平，且差異有顯著性（P＜0.01），見Fig 7。

4　討論

脂肪細胞是全身能量與代謝的關鍵調節者［10］。當血糖濃度升高時，胰島素誘導脂肪細胞攝取葡萄糖轉化為脂質。T2DM患者由于肝臟、脂肪和肌肉等組織的胰島素抵抗，導致血糖持續升高［11］。因此，增加脂肪細胞的胰島素敏感度和葡萄糖攝取是治療T2DM的手段之一。

Fig 3 Emodin enhanced mRNA expression of Adiponectin（A），chREBP-α（C），chREBP-β（D）and protein expression of p-IRS-1／total IRS-1（B）in 3T3-L1 adipocytes（n＝3）

Fig 4 Emodin enhanced protein expression of p-AMPK／total AMPK（A）and enhanced 6-NBDG uptake and uptake was inhibited by compound C（B）in 3T3-L1 adipocytes（n＝3）

Fig 5 Emodin enhanced protein expression of PPARγ（A）and enhanced 6-NBDG uptake and uptake was inhibited by GW9662（B）in 3T3-L1 adipocytes（n＝3）

Fig 6 Emodin enhanced protein expression of cell surface GLUT4（A）and mRNA expression of Adiponectin（B）in adipose tissue of T2DM rats（n＝4）

Adiponectin是內源性胰島素增敏激素［12］，IRS-1是胰島素受體的底物之一［13］，大黃素能夠促進二者的表達，提示大黃素可通過激活Adiponectin和IRS-1，提高3T3-L1脂肪細胞對胰島素的敏感度。chREBP-α和chREBP-β是體內脂肪生成和糖分解的轉錄調控因子［10］，chREBP的激活可促進葡萄糖向脂質轉化。本實驗研究結果顯示，大黃素的降糖作用可能通過激活脂肪細胞chREBP的轉錄和促進脂肪細胞表面葡萄糖轉運體GLUT4的葡萄糖轉運實現的。同時，大黃素可激活3T3-L1脂肪細胞AMPKα1／2和PPARγ的表達，并且經AMPK和PPARγ抑制后，大黃素對3T3-L1脂肪細胞的葡萄糖攝取作用的影響明顯減弱，表明大黃素促進3T3-L1脂肪細胞對葡萄糖的攝取與AMPK和PPARγ的信號通路有關。

綜上所述，大黃素可增加3T3-L1脂肪細胞的胰島素敏感度，促進3T3-L1脂肪細胞的葡萄糖攝取功能，發揮降血糖作用，其作用機制與激活Adiponectin 及IRS-1，進而激活AMPK和PPARγ的信號通路有關。

Fig 7 Emodin enhanced protein expression of p-AMPK／total AMPK in adipose tissue of T2DM rats（n＝4）

（致謝：本實驗在福建省中藥學重點實驗室完成，感謝實驗室的老師對本實驗的幫助與指導。）

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Activation of AMPK and PPARγ by emodin influences glucose uptake in 3T3-L1 adipocytes

HONG Hai-mian，XIE Xiu-li，HONG Gui-zhu，LAI Wen-fang
（College of Pharmacy，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350122，China）

Abstract：Aim To investigate glucose uptake effects and mechanism of emodin in 3T3-L1 adipocytes．Methods LPS-induced differentiated 3T3-L1 adipo-cytes were divided into control group and emodin（1，10，50 μmol·L－1）groups．Then，6-NBDG uptake and the expression of cell surface GLUT4，PPARγ，AMPKα1／2，p-AMPKα1／2，IRS-1，p-IRS-1，Adi-ponectin，chREBP-α and chREBP-β were detected．The ability of 6-NBDG uptake in LPS-induced 3T3-L1 adipocytes was also evaluated following interference with AMPK inhibitor and PPARγ inhibitor，respective-ly．Meanwhile，STZ-induced diabetic rats were ran-

domly divided into control group and emodin treatment group．The mRNA expression of Adiponectin and pro-tein expression of cell surface GLUT4，AMPKα1／2，p-AMPKα1／2 were measured．Results Compared with the control group，emodin improved the mRNA expres-sion of cell surface GLUT4，Adiponectin，chREBP-α and chREBP-β，and protein expression of cell surface GLUT4，PPARγ，IRS-1，p-IRS-1，AMPKα1／2 and p-AMPKα1／2 in 3T3-L1 adipocytes（P＜0.05）．Emodin enhanced 6-NBDG uptake and the uptake of emodin group was both decreased following interference with AMPK inhibitor and PPARγ inhibitor，respectively（P＜0.05）．Emodin also increased the mRNA expression of Adiponectin and protein expression of cell surface GLUT4，AMPKα1／2 and p-AMPKα1／2 in adipose tis-sue of T2DM rats（P＜0.05）．Conclusion Emodin can enhance glucose uptake in 3T3-L1 adipocytes and the mechanism is probably associated with activating Adiponectin and IRS-1，thereby activating AMPK and PPARγ．

Key words：emodin；type 2 diabetes mellitus；glucose uptake；3T3-L1 cells；glucose transporter type 4；AMPK；PPARγ

作者簡介：洪海棉（1990－），男，碩士生，研究方向：藥理學，E-mail：xwzcghappy＠163．com；賴文芳（1985－），女，碩士，助理研究員，研究方向：藥理學，通訊作者，E-mail：laiwenfang08＠163．com

基金項目：福建省自然科學基金資助項目（No 2015J01328）；福建中醫藥大學校管課題（No X2015013-平臺）

收稿日期：2015－06－18，修回日期：2015－07－14

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）11－1569－07

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．11．018