嗎啡預處理對H9c2心肌細胞缺氧／復氧時microRNA表達的影響

韓正怡，何淑芳，程 潔，許士進，楊 婉，張 野

（安徽醫科大學第二附屬醫院麻醉科，安徽合肥 230601）

嗎啡預處理對H9c2心肌細胞缺氧／復氧時microRNA表達的影響

韓正怡，何淑芳，程 潔，許士進，楊 婉，張 野

（安徽醫科大學第二附屬醫院麻醉科，安徽合肥 230601）

中國圖書分類號：R-332；R322．11；R329．25；R342.2；R542.2；R845.22；R971.2

摘要：目的 探討嗎啡預處理（morphine preconditioning，MPC）對H9c2心肌細胞缺氧／復氧（hypoxia reoxygenation，H／R）時microRNA（miRNA）表達的影響，為明確其機制提供參考。方法 培養H9c2心肌細胞，隨機分為3組（n＝4）：①正常對照組（CON）：H9c2心肌細胞置于DMEM／F12細胞培養液常規培養；②缺氧／復氧組（H／R）：對心肌細胞行缺氧5 h／復氧1 h處理；③嗎啡預處理組（MPC＋H／R）：在H／R前，應用1 μmol·L－1嗎啡預處理10 min。處理結束后，采用CCK-8法檢測細胞增殖、化學比色法檢測細胞培養液中乳酸脫氫酶（LDH）活性、Annexin-V-FITC／PI雙染法檢測細胞凋亡、Western blot法檢測細胞內Fas蛋白表達、熒光定量RT-PCR法檢測細胞miRNA表達水平。結果 與CON組比，H／R組細胞活力降低，LDH活性升高，細胞凋亡率增加，Fas蛋白水平升高（P＜0.01）；MPC可明顯提高細胞活力，降低LDH活性，抑制細胞凋亡，降低Fas蛋白水平（P＜0.01）。qRT-PCR結果顯示，與CON組相比，H／R組miR-133a-5p、miR-133b-5p、miR-664-1-5p、miR-6216和let-7e-5p表達明顯下調，而MPC能明顯地抑制H／R對這些miRNA表達的下調作用（P＜0.01）。結論 嗎啡預處理減輕H9c2心肌細胞缺氧／復氧損傷可能與調控miR-133a-5p、miR-133b-5p、miR-664-1-5p、miR-6216和let7e-5p等miRNA表達有關。

關鍵詞：嗎啡預處理；H9c2心肌細胞；缺氧／復氧；凋亡；Fas；微小RNA

網絡出版時間：2015－10－16 9：52 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20151016．0952．030．html

心肌缺血／再灌注損傷（ischemia reperfusion in-jury，IRI）常發生于急性心肌梗死溶栓治療后、冠狀動脈成形或搭橋術后，以及體外循環手術過程中等，嚴重影響缺血后心臟功能的恢復，威脅患者的生命安全。缺血預處理（ischemic preconditioning，IPC）是迄今為止最有效的內源性心肌保護方法［1］。本課題組前期研究表明，阿片類藥物如嗎啡、瑞芬太尼預處理可模擬IPC發揮心肌保護效應［2－4］。然而，阿片預處理（opioid preconditioning，OPC）的心肌保護機制可能涉及多種信號通路和分子，其確切分子機制尚不明確。

microRNA（miRNA）是近年來新發現的內源性、單鏈、非編碼小RNA。已知miRNA參與調控心肌細胞凋亡，在心肌缺血、再灌注以及預處理過程中均發揮重要作用［5］。最近研究表明，miRNA還參與阿片相關的多種生物學過程，如藥物成癮與耐受、鎮痛、免疫調節、病毒感染以及阿片受體調節等［6］。但OPC是否通過miRNA來調控相應的靶基因和信號通路發揮心肌保護作用，目前尚未見報道。本課題組前期利用miRNA芯片技術研究發現，嗎啡預處理（morphine preconditioning，MPC）可誘導大鼠心肌細胞miRNA表達譜發生明顯改變。在此基礎上，本研究擬進一步探討MPC對H9c2心肌細胞缺氧／復氧（hypoxia reoxygenation，H／R）時miR-133a-5p、miR-133b-5p、miR-664-1-5p、miR-6216和let-7e-5p表達的影響，為OPC的心肌保護作用機制研究提供新的理論依據。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1細胞株 大鼠H9c2（2-1）胚胎心肌細胞株

（中科院上海細胞庫）。

1．1．2藥物與試劑 鹽酸嗎啡注射液1 mL：10 mg（東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，批號：121206-2）。DMEM／F12細胞培養液購自美國Hy-clone公司；胎牛血清、0.25%胰酶消化液購自加拿大Wisent公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；細胞增殖檢驗試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）購自日本同仁化學研究所；乳酸脫氫酶（lactic acid dehy-drogenase，LDH）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Annexin-V-FITC／PI雙染凋亡試劑盒購自美國鉑優公司；PVDF膜購自美國Bio-Rad公司；鼠抗β-actin單克隆抗體、兔抗Fas多克隆抗體購自美國Santa Cruz生物技術公司；HRP標記羊抗兔、羊抗鼠抗體購自北京中杉生物技術公司；ECL發光試劑盒購自美國Pierce公司；All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection Kit及miRNA引物均購自廣州復能基因有限公司。

1．1．3儀器 細胞培養箱（美國Thermo公司）；缺氧小室（加拿大Stem Cell公司）；KHB ST-360酶標儀（中國上海科華實驗系統有限公司）；Cytomics FC 500流式細胞儀（美國Beckman公司）；CXY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）；Tanon Fine Do X6全自動化學發光圖像分析系統（上海天能科技有公司）；熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

1．2方法

1．2．1細胞培養 大鼠H9c2（2-1）胚胎心肌細胞株置于37℃、5%CO2培養箱（95%空氣）中，含10%胎牛血清的DMEM／F12完全培養液培養。細胞貼壁80%～90%時，用0.25%胰酶0.02%EDTA消化，計數，以1∶3的比例傳代，每2～3天傳代1次。取對數生長期的細胞用于后續實驗。

1．2．2心肌缺氧／復氧損傷模型的建立 參照文獻［7］并加以改良進行。心肌細胞生長達90%后，棄去含10%胎牛血清的DMEM／F12培養液，加入無血清無糖的缺氧液，并將細胞置于缺氧小室，通入95%N2＋5%CO2的混合氣飽和5 min，驅除氧氣。置于37℃培養箱中培養5 h實施缺氧，用含10%胎牛血清的DMEM／F12正常培養1 h模擬復氧。

1．2．3實驗分組及處理 依據不同的實驗要求，對細胞進行如下分組處理：對照組（CON）細胞正常培養；缺氧／復氧組（H／R）細胞行缺氧5 h／復氧1 h處理；嗎啡預處理組（MPC＋H／R）細胞參照前期及預實驗結果，以含嗎啡（終濃度為1 μmol·L－1）的無血清DMEM／F12孵育細胞10 min，再進行H／R處理。每組4個復孔（n＝4）。

1．2．4CCK-8法檢測細胞增殖 取對數生長期心肌細胞，接種于96孔培養板內，每孔4×103個細胞，置于37℃、5%CO2培養箱培養。按上述方法進行分組及處理，結束后每孔加入10 μL CCK-8溶液（加入的體積為原來培養體積的10%），細胞培養箱內繼續孵育4 h，置于酶標儀上450 nm測定各組吸光度。在不含細胞的培養液中加入等量CCK-8溶液，按相同方法測定吸光度作為空白對照孔。細胞增殖活力＝測定的吸光度－空白對照孔吸光度，并計算平均值。實驗獨立重復4次。

1．2．5乳酸脫氫酶（LDH）活性的測定 接種于96孔培養板的心肌細胞，于H／R結束后，每組各取40 μL培養液，嚴格按照LDH試劑盒說明書操作，利用化學比色法檢測LDH活性。實驗獨立重復4次。

1．2．6Annexin-V-FITC／PI雙染法檢測細胞凋亡取對數生長期的H9c2心肌細胞，調整細胞濃度為每孔2×106個細胞，接種到6孔板中，置于37℃、5%CO2培養箱培養。按上述方法進行分組及處理，H／R結束后，用不含EDTA的胰酶消化并收集細胞，1 500 r·min－1離心（離心半徑16 cm）5 min，PBS漂洗2次，收集細胞。用500 μL的Annex-in-V Binding Buffer重懸細胞，每組加入5 μL的An-nexin-V-FITC混勻，再加入5 μL的PI混勻。室溫下避光孵育10 min，轉移入流式管中，采用流式細胞儀測定細胞凋亡率。以未染色細胞調零，以Annex-in-V-FITC單染管和PI單染管作為基準參照，測定每個上樣管數據，每個樣本均獲取10 000個細胞，用FCS Express V 3．0軟件進行分析。實驗獨立重復4次。

1．2．7Western blot法檢測Fas蛋白水平 接種于6孔培養板的心肌細胞，H／R結束后，棄培養液。4℃預冷PBS清洗細胞，培養板中加入蛋白裂解液充分裂解細胞，15 000 r·min－14℃離心10 min，吸取上清，BCA法測定樣品蛋白含量后分裝保存。每組取10 μg蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳后將蛋白轉移至PVDF膜。將PVDF膜在封閉液（含5%脫脂牛奶的TBST溶液）中室溫孵育1 h，隨后置于兔抗Fas多克隆抗體或鼠抗β-actin單克隆抗體中，4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次；再將膜置入辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗中室溫孵育1 h，TBST洗膜3次；采用ECL發光試劑盒，在Tanon全自動凝膠成像系統中自動曝光采集圖像，并進行條帶光密度分析。

1．2．8熒光定量RT-PCR檢測心肌細胞miRNAs表達水平 接種于6孔培養板的心肌細胞，H／R結

束后，棄培養液收集細胞。按照RNA提取試劑TR-Izol的說明書進行操作，每孔加1 mL TRIzol置于冰上裂解15 min，提取細胞總RNA。經氯仿萃取，異丙醇法沉淀，75%無水乙醇洗滌法濃縮，DEPC水溶解后，用紫外分光光度計檢測總RNA的濃度和純度，制成RNA樣品。按照All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection Kit試劑盒說明書，將RNA逆轉錄為cDNA后用于檢測miR-133a-5p、miR-133b-5p、miR-664-1-5p、miR-6216、let-7e-5p及內參基因U6的表達量（引物序列保密）。逆轉錄反應條件為：37℃60 min，85℃5 min；PCR擴增條件為：95℃預變性10 min，95℃10 s，60℃30 s，重復45個循環進行擴增；反應結束后建立溶解曲線。同時設去離子水陰性對照，采用U6 RNA作為各組內標，進行歸一化。采用StepOne Software v 2．3軟件進行數據分析。同一實驗重復4次，實驗數據分析采用2－△△CT法計算［8］。

1．2．9統計學分析 采用SPSS 10．0統計軟件進行分析，計量資料±s表示，多組間數據比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用SNK檢驗。

2　結果

2．1MPC增加H9c2心肌細胞活力 各組經過處理后，心肌細胞活力分別為：CON組（1.43±0.08）、H／R組（0.69±0.10）、MPC＋H／R組（1.11± 0.12）。與CON組相比，H／R可明顯降低心肌細胞活力（P＜0.01），而MPC則明顯增加心肌細胞活力（P＜0.01），見Fig 1。

Fig 1 Morphine preconditioning increased cell viability in H9c2 myocardial cells（±s，n＝4）

2．2MPC降低H9c2心肌細胞LDH活性 心肌細胞培養液中的LDH水平可反映細胞損傷程度。與CON組（120±10）相比，H／R組LDH活性明顯升高（281±10，P＜0.01）；而MPC則可以明顯減輕H／R損傷，培養液中LDH活性明顯降低（151±10，P＜0.01）（單位：IU·L－1），見Fig 2。

Fig 2 Morphine preconditioning reduced LDH activity in H9c2 myocardial cells（±s，n＝4）

2．3MPC抑制H9c2心肌細胞凋亡 在流式細胞散點分析圖上劃十字門，如Fig 3A所示，正常細胞顯示為圖中左下區細胞簇（FITC－PI－），早期凋亡細胞顯示為圖中右下區細胞簇（FITC＋PI－），晚期凋亡及死亡細胞顯示為圖中右上區細胞簇（FITC＋PI＋）。從Annexin-V-FITC／PI熒光雙參數點圖觀察到，CON組細胞主要分布在左下象限，細胞狀態良好，右下象限為少量凋亡細胞（FITC＋PI－：3.2%± 1.2%）；H／R組右下象限出現大量凋亡細胞（FITC＋PI－：25.4%±2.4%，P＜0.01）；而MPC＋H／R組凋亡細胞明顯減少（FITC＋PI－：9.3%±1.6%，P ＜0.01）（Fig 3B），說明MPC可抑制H／R損傷誘導的心肌細胞凋亡。

2．4MPC降低H9c2心肌細胞Fas蛋白表達 Fas蛋白是細胞內重要的凋亡調控蛋白。Western blot結果顯示，H／R損傷組細胞內Fas蛋白表達水平明顯升高，是CON組的（1.7±0.2）倍（P＜0.01）；而MPC則下調細胞內Fas蛋白表達，與H／R組相比，差異具有統計學意義（1.2±0.4，P＜0.01），見Fig 4。說明MPC可抑制凋亡蛋白Fas表達，減輕H／R損傷。

2．5MPC對H9c2心肌細胞miRNA表達水平的

影響 熒光定量RT-PCR結果顯示，與CON組相比，H／R損傷組miR-133a-5p、miR-133b-5p、miR-664-1-5p、miR-6216、let-7e-5p的表達水平均明顯下調，分別降低至（0.34±0.06）、（0.18±0.06）、（0.28±0.02）、（0.29±0.02）、（0.29±0.03）（P＜0.05），而MPC減輕心肌細胞損傷的同時，也可明顯上調上述miRNA在心肌細胞的表達水平，分別升高至（4.29±0.42）、（5.72±0.63）、（7.37±0.51）、（7.71±0.29）、（9.39±0.48）（P＜0.01），見Fig 5。

Fig 3 Morphine preconditioning inhibited apoptosis in H9c2 myocardial cells（±s，n＝4）

Fig 4 Morphine preconditioning decreased Fas protein expression in H9c2 myocardial cells（±s，n＝4）

Fig 5 Expression of miRNAs in each group（±s，n＝4）

3　討論

嗎啡是臨床麻醉中常用的一種非選擇性的阿片類鎮痛藥，常用于心血管手術麻醉和術后鎮痛，以激動μ受體為主，同時也激動δ和κ阿片受體［9］。本實驗根據參考文獻［7］并加以改良，建立H9c2心肌細胞缺氧／復氧損傷模型，并參照前期及預實驗結果，選擇濃度為1 μmol·L－1的嗎啡進行預處理。結果顯示，MPC明顯增強心肌細胞活力，降低H／R損傷導致的LDH活性升高，并抑制心肌細胞凋亡，說明MPC可以減輕心肌細胞H／R損傷，發揮心肌保護作用。Fas是一種分子質量為48 ku的跨膜糖

蛋白，它與FasL結合后介導的凋亡通路是經典的凋亡途徑之一。Fas受體活化后可激活下游的caspase凋亡級聯信號，導致心肌細胞凋亡，在心肌缺血／再灌注損傷中發揮關鍵作用［10］。本研究發現，MPC可降低H／R誘導的心肌細胞內Fas蛋白表達，提示了MPC可能通過抑制Fas介導的凋亡信號發揮心肌保護作用。

miRNA是生物體內長度約22個核苷酸的非編碼小RNA，廣泛表達于各個組織和器官。它們以不完全互補的方式與成熟mRNA結合，抑制mRNA的翻譯或使mRNA降解，在轉錄后水平調節蛋白質的表達，參與調控細胞多個生物學過程。在miRNA與心肌損傷、凋亡的研究中，Yin等［11］發現，心肌缺血預處理時miR-21、miR-221、miR-224表達上調，于動物的心肌缺血區注射這些miRNA能減少心肌缺血／再灌注損傷。表明miRNA在心肌損傷、心肌細胞凋亡過程中起到了重要的調控作用，可能成為抗心肌缺血／再灌注損傷治療的重要靶點。已有研究報道，嗎啡可下調腦組織miR-133b表達，調節多巴胺神經元的功能［12］；此外，let-7家族可與μ受體結合，轉錄后抑制阿片受體活性［13］。說明阿片類發揮生物學作用可能通過調控miRNA表達來實現。然而，阿片預處理發揮心肌保護作用是否涉及miRNA調控機制，目前尚未見報道。本實驗通過熒光定量RT-PCR，檢測各組miRNA表達水平的變化，結果顯示，在H／R損傷組中明顯下調的miR-133a-5p、miR-133b-5p、miR-664-1-5p、miR-6216、let-7e-5p均被MPC明顯上調，提示MPC可能通過調控這些miR-NA表達，減輕H9c2心肌細胞H／R損傷，發揮心肌細胞保護作用。

這些受MPC調控的miRNA中，miR-133a與miR-133b同屬miR-133家族。研究表明，在心肌梗死或心臟缺血／再灌注過程中，miR-133a、miR-133b表達均明顯下降［14－15］。miR-133a已被證明具有抗心肌細胞凋亡作用，上調心肌內miR-133a表達可明顯減輕缺血／再灌注損傷，改善心臟功能［16］，可能與其負性調控促凋亡基因caspase-9有關［17］。miR-133b參與調控心肌細胞凋亡，但其具體作用機制尚不明確。我們通過靶基因預測軟件對miR-133b-5p的靶基因進行分析，發現Fas基因的3’-UTR端與miR-133b-5p的種子序列匹配，可能是其關鍵靶基因之一。因此，我們推測MPC上調心肌細胞miR-133a和miR-133b的表達，可能與抑制凋亡信號通路Fas、caspase-9相關，進而抑制心肌細胞凋亡，減輕H／R損傷。其他miRNA如miR-664-1-5p、miR- 6216、let-7e-5p在心肌缺血／再灌注損傷或心肌細胞凋亡中的作用尚不清楚，在MPC介導的心肌保護效應中作用機制也有待進一步探討。

綜上所述，本研究證明嗎啡預處理可明顯減輕H9c2心肌細胞缺氧／復氧損傷，其機制可能與影響miR-133a-5p、miR-133b-5p、miR-664-1-5p、miR-6216 和let-7e-5p等miRNA表達有關，為進一步研究嗎啡預處理的miRNA調控機制提供了基礎。

（致謝：感謝安徽醫科大學第二附屬醫院中心實驗室為本課題研究提供儀器設備和技術支持。）

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Effects of morphine preconditioning on expression of microRNAs during hypoxia-reoxygenation in H9c2 myocardial cells

HAN Zheng-yi，HE Shu-fang，CHENG Jie，XU Shi-jin，YANG Wan，ZHAGN Ye
（Dept of Anesthesiology，the Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601，China）

Abstract：Aim To evaluate the effects of morphine preconditioning（MPC）on the expression of microR-NAs（miRNAs）induced by hypoxia-reoxygenation （H／R）in H9c2 myocardial cells．Methods H9c2 cells were randomly divided into 3 groups（n＝4 each）as follows：control group（CON），hypoxia／reoxygen-ation group（H／R）and morphine preconditioning group（MPC＋H／R）．The cells were cultured in nor-mal condition in CON group．The cells were subjected to 5 h hypoxia followed by 1 h reoxygenation in H／R group and MPC＋H／R group．Specifically，the cells in MPC＋H／R group were preconditioned with morphine with the final concentration of 1 μmol·L－1for 10 min before H／R．After the treatment，CCK-8 was used to detect cell viability and chemical colorimetry was used to detect lactate dehydrogenase（LDH）activity in the culture medium．Cell apoptosis was assessed by An-nexin-V-FITC／PI flow cytometry．Relative expression of Fas protein was detected by Western blot．The ex-pression of miRNA in myocardial cells was analyzed by quantitative reverse transcription polymerase chain re- action（qRT-PCR）．Results Compared with CON group，the cell viability was significantly decreased，while the LDH activity，apoptotic rate and Fas protein expression were dramatically increased in group H／R （P＜0.01）．However，MPC significantly increased the cell viability，whereas it decreased the LDH activity，apoptotic rate and Fas protein expression induced by H／R injury（P＜0.01）．The expressions of miR-133a-5p，miR-133b-5p，miR-664-1-5p，miR-6216 and let-7e-5p were markedly down-regulated by H／R as compared to CON group（P＜0.05），while MPC inhibited these miRNAs which were significantly down-regulated by H／R group（P＜0.01）．Conclusion Morphine preconditioning might protect H9c2 myocar-dial cells against H／R injury by regulating the expres-sion of miRNAs such as miR-133a-5p，miR-133b-5p，miR-664-1-5p，miR-6216 and let-7e-5p．

Key words：morphine preconditioning；H9c2 myocar-dial cells；hypoxia-reoxygenation；apoptosis；Fas；mi-croRNAs

作者簡介：韓正怡（1991－），女，碩士，研究方向：麻醉藥理學，E-mail：15155971268＠163．com；張 野（1968－），男，博士，教授，主任醫師，博士生導師，研究方向：麻醉藥理學，通訊作者，Tel：0551-63869480，E-mail：zhangye＿hassan＠sina．com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 81200171）；安徽省科技廳年度重點項目（No 1301043030）；安徽省高校省級自然科學研究重大項目（No KJ2014ZD16）

收稿日期：2015－06－13，修回日期：2015－07－18

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）11－1552－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．11．015