原花青素B2對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

張曉暉，曾繁典，孫智達(dá)，楊卓欣，熊益群，徐超英，劉心亮，林 堅(jiān)，穆桂萍，徐紹鋼，劉文赫

（1．深圳市中醫(yī)院中醫(yī)藥研究所，廣東深圳 518033；2．華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥理系，湖北武漢 430030；3．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430070）

原花青素B2對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

張曉暉1，曾繁典2，孫智達(dá)3，楊卓欣1，熊益群1，徐超英1，劉心亮1，林 堅(jiān)1，穆桂萍1，徐紹鋼1，劉文赫1

（1．深圳市中醫(yī)院中醫(yī)藥研究所，廣東深圳 518033；2．華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥理系，湖北武漢 430030；3．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430070）

中國(guó)圖書(shū)分類(lèi)號(hào)：R-332；R284．1；R322．11；R329．25；R542．2

摘要：目的 研究原花青素B2（procyanidin B2，PCB2）對(duì)脂多糖（lipopolysacchride，LPS）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 采用原代培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞，LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷模型，PCB2低、中、高劑量組分別用含有6.25、12.5、25.0 μmol·L－1PCB2的DMEM培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)24 h。采用四唑鹽（MTT）比色法測(cè)定心肌細(xì)胞存活率，光澤精化學(xué)發(fā)光法測(cè)定心肌細(xì)胞NOX的活性，Western blot法分析心肌NADPH氧化酶p47phox亞基的表達(dá)，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定心肌細(xì)胞ROS的含量。結(jié)果 LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷組與正常對(duì)照組（Control）比較，心肌細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.01），而心肌細(xì)胞NOX活性、p47phox亞基的表達(dá)、凋亡細(xì)胞數(shù)量以及ROS含量均明顯增加（P＜0.01）。PCB2處理后，低、中、高劑量組細(xì)胞活力均明顯升高，心肌細(xì)胞NOX活性、p47phox亞基的表達(dá)、凋亡細(xì)胞數(shù)量以及ROS含量均明顯下降，且具有劑量依賴(lài)性（P＜0.01）。結(jié)論 PCB2通過(guò)抑制NADPH氧化酶激活、p47phox的表達(dá)以及活性氧的產(chǎn)生發(fā)揮對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：原花青素B2；脂多糖；心肌細(xì)胞；凋亡；NADPH氧化酶；活性氧自由基

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－10－16 9：52 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20151016．0952．016．html

在膿毒癥中，心臟受影響最為常見(jiàn)，膿毒癥合并心功能衰竭，死亡率高達(dá)70%～90%［1］，臨床救治相當(dāng)困難。但膿毒癥心功能不全的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制目前尚不完全清楚。近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥心功能不全可能與細(xì)胞凋亡［2］和活性氧（reactive oxygen spe-cies，ROS）大量產(chǎn)生［3］有關(guān)。抗氧化劑的早期干預(yù)對(duì)于膿毒癥心肌細(xì)胞凋亡可能具有積極的意義。

天然植物藥作為天然抗氧化劑受到越來(lái)越多的重視，許多研究提示天然植物藥相比于化學(xué)藥物無(wú)明顯副作用的特點(diǎn)使其更具開(kāi)發(fā)潛力。原花青素（procyanidins，PC）廣泛存在于植物中，是一種由單體（主要是兒茶素、表兒茶素等）、低聚原花青素（單體的二、三、四聚合物體）和高聚原花青素（五聚體以上）組成的化合物。其中二聚體在各類(lèi)原花青素中分布最廣，抗氧化活性最強(qiáng)，是最重要的一類(lèi)。二聚體因兩個(gè)單體的構(gòu)象或縮合鍵位不同，有多種異構(gòu)體，現(xiàn)已鑒定的8種異構(gòu)體命名為B1～B8，其中B1～B4由C4－C8鍵合，B5～B8由C4－C6鍵合。在8種異構(gòu)體中原花青素B2是活性最強(qiáng)的一個(gè)二聚體［4］，它的結(jié)構(gòu)式如Fig 1。

Fig 1 Structure of procyanidin B2

二聚體原花青素B2是葡萄籽原花青素提取物的組分之一，它的生物學(xué)活性較其他水溶性多酚更強(qiáng)［1］。已經(jīng)證實(shí)原花青素，尤其是原花青素B2具有清除自由基、抗氧化［5－6］、抗腫瘤［7－8］、抗炎癥［9－10］、抗凋亡［11］以及抗動(dòng)脈粥樣硬化［12］等作用。

我們前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從荔枝殼提取的原花青素預(yù)處理能夠明顯減輕膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞凋亡，可能與其抗氧化性損傷作用有關(guān)［13］。另外，原花青素還能通過(guò)抑制NADPH氧化酶的活性達(dá)到抗血小板聚集的作用［14］。那么，原花青素中活性最強(qiáng)的原花青素B2是否通過(guò)NADPH氧化酶途徑達(dá)到抗膿毒癥心肌細(xì)胞凋亡的作用，目前還不清楚。本研究以脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷為模型，從NADPH氧化酶／活性氧途徑探討原花青素B2對(duì)心

肌細(xì)胞凋亡的作用，將有助于更深入研究原花青素B2的藥理學(xué)作用機(jī)制。

1　材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)材料 出生24 h內(nèi)Sprague-Dawley（SD）新生乳鼠由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；原花青素B2（procyanidin B2，PCB2）、脂多糖（lipopolysac-chride，LPS）、Lucigenin、NAD（P）H、α-actin antibody均購(gòu)自Sigma；TUNEL試劑盒購(gòu)自Roche；p47phoxAn-tibody購(gòu)自Cell Signaling Technology；lysotracker-blue、Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor488＆PI-for Flow Cytometry、CellROXDeep Red Flow Cytometry Assay Kit均購(gòu)自Invitrogen；Tiron購(gòu)自Fluka。

1．2原代心肌細(xì)胞培養(yǎng) 采用文獻(xiàn)的方法［15］，無(wú)菌操作取出生24 h內(nèi)健康SD乳鼠左心室，剪碎成1 mm×1 mm×1 mm大小，加入適量0.15%胰蛋白酶，37℃水浴下輕柔攪動(dòng)、反復(fù)消化，制備心肌細(xì)胞懸液，差速貼壁。用含15%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為每瓶3×106個(gè)，接種于底面積為75 cm2的培養(yǎng)瓶，置CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行原代培養(yǎng)。

1．3分組與造模 模型復(fù)制選擇LPS 5、25、50 mg ·L－1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，選用細(xì)胞存活率約為60%的濃度為實(shí)驗(yàn)復(fù)制模型濃度。選擇2、4、8、12、24 h作為分析損傷的時(shí)間點(diǎn)，選用細(xì)胞存活率在60%左右的時(shí)間點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)復(fù)制模型時(shí)間。LPS對(duì)心肌細(xì)胞的損傷隨著濃度的增大而增強(qiáng)，當(dāng)濃度在25 mg·L－1時(shí)，細(xì)胞存活率在61.25%，同時(shí)LPS對(duì)心肌細(xì)胞的損傷隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，用25 mg·L－1LPS對(duì)心肌細(xì)胞持續(xù)作用達(dá)24 h，細(xì)胞存活率在60.22%。因此，本實(shí)驗(yàn)研究選用25 mg·L－1LPS作用心肌細(xì)胞24 h復(fù)制細(xì)胞損傷模型。

取原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞，置于CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h，換無(wú)新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液同步化24 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為以下6組：①正常對(duì)照（Control）組：細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)基中持續(xù)培養(yǎng)24 h；②LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷組：細(xì)胞置于含有25 mg·L－1LPS的DMEM培養(yǎng)基中持續(xù)培養(yǎng)24 h；③PCB2低劑量組：細(xì)胞置于含有25 mg·L－1LPS和6.25 μmol·L－1PCB2的DMEM培養(yǎng)基中持續(xù)培養(yǎng)24 h；④PCB2中劑量組：細(xì)胞置于含有25 mg·L－1LPS和12.5 μmol·L－1PCB2的DMEM培養(yǎng)基中持續(xù)培養(yǎng)24 h；⑤PCB2高劑量組：細(xì)胞置于含有25 mg·L－1LPS和25 μmol·L－1PCB2的DMEM培養(yǎng)基中持續(xù)培養(yǎng)24 h。

1．4檢測(cè)指標(biāo)

1．4．1細(xì)胞活力檢測(cè) 采用MTT比色法檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率。各組細(xì)胞以5×107·L－1的細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)。待細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)2 d后，加入不同濃度LPS處理相應(yīng)的時(shí)間，然后每孔加入濃度為5 g·L－1的MTT液20 μL，37℃孵育4 h，棄培養(yǎng)上清液，再每孔加入二甲基亞砜150 μL，充分溶解結(jié)晶后，酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定各孔的吸光度值，即OD值，以間接反映各組活細(xì)胞數(shù)量。

1．4．2光澤精化學(xué)發(fā)光法測(cè)定心肌細(xì)胞NOX的活性 細(xì)胞處理結(jié)束后，用4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入Jude Krebs buffer［Jude Krebs（JK）Buffer：119 mmol·L－1NaCl，20 mmol·L－1Hepes，4.6 mmol·L－1KCl，1 mmol·L－1MgSO4，0.15 mmol· L－1Na2HPO4·2H2O，136.09 mmol·L－1KH2PO4，84.01 mmol·L－1NaHCO3，147 mmol·L－1CaCl2，180.2 mmol·L－1glucose，使用前加入protease in-hibitor cocktail（Roche）］，刮下細(xì)胞。冰上超聲后4°C離心，800×g，4 min。取少量樣本進(jìn)行蛋白定量（Bradford法）。避光96孔板內(nèi)加入40 μg的細(xì)胞蛋白，5 μL DMSO，10 μmol·L－1lucigenin，50 mmol·L－1Tiron，加入新鮮配制的NADPH 100 μmol·L－1啟動(dòng)反應(yīng)，以化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，酶活性檢測(cè)結(jié)果以每μg蛋白的光單位表示（light unit）。

1．4．3Western blot法分析心肌NADPH氧化酶p47phox亞基的表達(dá)并定量 收集細(xì)胞蛋白后，采用15%濃度的聚丙烯酰胺凝膠測(cè)目的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉后，將一抗（1∶500）4℃孵育過(guò)夜后，用TBST每次7 min洗2次后，用相應(yīng)的稀釋好的二抗（HRP標(biāo)記二抗，1∶3 000，F(xiàn)orevergen）室溫下孵育1～2 h，用TBST每次7 min洗3次后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影（ECL，F(xiàn)orevergen）。用Image J分析目標(biāo)條帶的光密度值。以GAPDH（1∶5 000）作為內(nèi)參照，比較不同處理后上述蛋白表達(dá)的差異。

1．4．4TUNEL法測(cè)定細(xì)胞凋亡 按TUNEL試劑盒的說(shuō)明逐步添加試劑，檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。每片隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率即細(xì)胞凋亡率（每一片100個(gè)細(xì)胞核中凋亡核所占的百分比）。

1．4．5流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定心肌細(xì)胞ROS的含量 細(xì)胞處理結(jié)束后，用4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞后收集，將配制好的10

μmol·L－1DCFH-DA溶液500 μL重懸細(xì)胞，37℃孵育30 min，離心，800×g，5 min，棄上清，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，制成1×108cells·L－1的懸液，立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以488 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，530 nm為發(fā)射波長(zhǎng)。

2　結(jié)果

2．1PCB2對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞活力的影響 用MTT的方法評(píng)價(jià)PCB2是否對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。如Fig 2所示，LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷組（LPS）與正常對(duì)照組（Control）比較，心肌細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.01），PCB2低、中、高劑量組與LPS組相比細(xì)胞活力均明顯升高，且具有劑量依賴(lài)性（P＜0.01）。

Fig 2 Influence of PCB2on LPS-induced cell vitality（±s）

2．2PCB2對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞NOX活性的影響 NADPH氧化酶是心血管系統(tǒng)ROS的重要來(lái)源，因此我們觀察了心肌細(xì)胞NOX活性是否與PCB2的抗凋亡作用有關(guān)。如Fig 3所示，LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷組與正常對(duì)照組比較，心肌細(xì)胞NOX活性明顯增加（P＜0.01），PCB2低、中、高劑量組與LPS組相比，細(xì)胞NOX活性均明顯降低，且具有劑量依賴(lài)性（P＜0.01）。

2．3PCB2對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌NADPH氧化酶p47phox亞基表達(dá)的影響 用Western blot的方法分析NADPH氧化酶p47phox亞基的表達(dá)。如Fig 4所示，LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷組與正常對(duì)照組比較，p47phox亞基的表達(dá)明顯增加（P＜0.01），PCB2低、中、高劑量組與LPS組相比p47phox亞基的表達(dá)均明顯降低，且具有劑量依賴(lài)性（P＜0.01）。

2．4PCB2對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡，F(xiàn)ig 5結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷組與正常對(duì)照組比較，凋亡細(xì)胞明顯增加（P＜0.01）；PCB2低、中、高劑量組與LPS組相比凋亡細(xì)胞均明顯減少，且具有劑量依賴(lài)性（P＜0.01）。

Fig 3 Influence of PCB2on LPS-induced NOX activity（±s）

Fig 4 Influence of PCB2on LPS-induced p47phoxexpression（±s）

2．5PCB2對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ROS含量的影響 為了確定ROS是否涉及PCB2的抗凋亡作用，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS的含量。如Fig 6所示，LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷組與正常對(duì)照組比較，ROS含量明顯增加（P＜0.01）；PCB2低、中、高劑量組與LPS組

相比ROS含量均明顯減少，且具有劑量依賴(lài)性（P＜0.01）。

Fig 5 Influence of PCB2on LPS-induced apoptosis（±s）

Fig 6 Influence of PCB2on LPS-induced cardiacmyocyte ROS content（±s）

3　討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，原花青素B2能夠保護(hù)脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。這種保護(hù)作用與其抑制NADPH氧化酶的激活，NADPH氧化酶p47phox亞基的表達(dá)以及ROS的生成有關(guān)。

細(xì)胞凋亡與細(xì)胞內(nèi)大量產(chǎn)生的ROS有關(guān)。ROS作為細(xì)胞內(nèi)的一種信號(hào)分子，在細(xì)胞死亡過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用［16］。它能改變細(xì)胞信號(hào)，損傷蛋白質(zhì)和DNA，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［17］。氧化應(yīng)激可間接通過(guò)對(duì)DNA、脂質(zhì)和蛋白的損害，或更直接地激活A(yù)SK-1、JNK和ERK1／2等促凋亡信號(hào)分子而導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡［18］。脂多糖能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞ROS產(chǎn)生增加，ROS是具有高化學(xué)反應(yīng)活性的分子，在血管張力、細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、增殖、肥大，細(xì)胞凋亡和基質(zhì)沉積等許多生理和病理過(guò)程的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［19］。心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的來(lái)源包括線粒體電子傳遞鏈、黃嘌呤氧化酶、“非偶聯(lián)”的一氧化氮合酶、細(xì)胞色素P450和NADPH氧化酶。在這些來(lái)

源當(dāng)中，只有NADPH氧化酶是以高度受調(diào)節(jié)的方式產(chǎn)生ROS，是細(xì)胞內(nèi)ROS的主要來(lái)源［20］。NAD-PH氧化酶是由5個(gè)同型異構(gòu)體組成的酶家族：Nox1、Nox2、Nox3、Nox4、Nox5。酶復(fù)合體由2個(gè)位于細(xì)胞膜的亞基（gp91phox和gp22phox，兩者構(gòu)成細(xì)胞色素b558）和至少4種胞質(zhì)蛋白（p40phox、p47phox、p67phox和Rac-1／2，構(gòu)成胞質(zhì)復(fù)合體）組成。在心血管系統(tǒng)，Nox2、Nox4在內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中表達(dá)［21－23］。急性心肌梗死大鼠細(xì)胞損傷就與Nox2表達(dá)增加有關(guān)［24］。胞質(zhì)蛋白p47phox對(duì)激活Nox2起著關(guān)鍵性的作用［25］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)LPS處理以后，心肌細(xì)胞NOX活性明顯增強(qiáng)，p47phox表達(dá)以及ROS產(chǎn)生明顯增多；PCB2能明顯減弱NOX活性，減少p47phox的表達(dá)以及ROS的產(chǎn)生，并伴隨著心肌細(xì)胞凋亡的減少，提示PCB2是通過(guò)抑制NADPH氧化酶衍生的ROS，達(dá)到保護(hù)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的作用。目前有兩種以NADPH氧化酶為靶點(diǎn)的治療藥物：一種是抑制p47phox與Nox2的結(jié)合［26］，另一種是抑制轉(zhuǎn)錄因子Ets-1［27］和LOX-1［28］的表達(dá)，進(jìn)而抑制NADPH氧化酶的表達(dá)。PCB2是否通過(guò)上述機(jī)制發(fā)揮抑制NADPH氧化酶的作用，值得進(jìn)一步研究。

總之，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCB2通過(guò)抑制NADPH氧化酶激活、p47phox的表達(dá)以及活性氧的產(chǎn)生，發(fā)揮對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。我們的工作為PCB2對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用提供了新的見(jiàn)解，這有可能是未來(lái)作為臨床應(yīng)用治療膿毒癥相關(guān)的心肌細(xì)胞凋亡的一個(gè)潛在的藥理學(xué)基礎(chǔ)。

［致謝：本文實(shí)驗(yàn)在深圳市中醫(yī)院國(guó)家中醫(yī)藥科研三級(jí)實(shí)驗(yàn)室（No：TCM－2009－289）完成，在此表示衷心感謝。］

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Procyanidin B2protects LPS-induced myocardial cell apoptosis

ZHANG Xiao-hui1，ZENG Fan-dian2，SUN Zhi-da3，YANG Zhuo-xin1，XIONG Yi-qun1，XU Chao-ying1，LIU Xin-liang1，LIN Jian1，MU Gui-ping1，XU Shao-gang1，LIU Wen-he1
（1．Chinese Medicine Institute of Shenzhen TCM Hospital，Shenzhen Guangdong 518033，China；2．Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China；3．College of Food Science and Technology of Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）

Abstract：Aim To study the mechanisms of the pro-tective effect of procyanidin B2（PCB2）on the myocar-dial cell apoptosis induced by lipopolysaccharide （LPS）．Methods Using the primary culture rat myo-cardial cells，myocardial cell injury model was induced by LPS．PCB2low，medium and high dose groups，were cultured with 6.25，12.5，25.0 μmol·L－1PCB2respectively in DMEM medium for 24 h continu-ously．Myocardial cell survival rate was determined by MTT colorimetric method．Cardiacmyocyte NOX activi-ty was determined by lucigen chemiluminescence meth-od．Western blot analysis was used to detect myocardi-al NADPH oxidase p47phoxexpression．TUNEL method was used to detect apoptosis and flow cytometry was used to determine the content of myocardial cells ROS．Results Compared with control group，the cell dam- age induced by LPS group myocardial cell survival rate significantly decreased（P＜0.01），and myocardial cell NOX activity，p47phoxexpression，apoptotic cell number and ROS content were significantly increased （P＜0.01）．PCB2low，medium and high dose groups cell survival rates were significantly elevated，myocar-dial cell NOX activity and p47phoxexpression，apoptotic cell number and the ROS content decreased significant-ly in a dose-dependent manner（P＜0.01）．Conclu-sion PCB2protects myocardial cell apoptosis induced by LPS via inhibiting the expression of NADPH oxidase activation，p47phoxexpression and reactive oxygen spe-cies generation．

Key words：procyanidin B2；lipopolysacchride；car-diomyocyte；apoptosis；NADPH oxidase；reactive oxy-gen species

通訊作者

作者簡(jiǎn)介：張曉暉（1975－），女，博士，副主任藥師，研究方向：心血管藥理學(xué)、中藥藥理學(xué)，，Tel：0755-88359666，E-mail：767682665＠qq．com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 81101450）；深圳市科技研發(fā)資金知識(shí)創(chuàng)新計(jì)劃資助項(xiàng)目（No JCYJ20130329 155553734）

收稿日期：2015－07－31，修回日期：2015－08－23

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）11－1510－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．11．008