DP2干預(yù)對(duì)鋁負(fù)荷原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元的作用觀察

陽群芳，魏玉玲，楊俊卿

（重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016）

DP2干預(yù)對(duì)鋁負(fù)荷原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元的作用觀察

陽群芳，魏玉玲，楊俊卿

（重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016）

中國圖書分類號(hào)：R-332；R155.52；R322.81；R338.1；R348.4；R977.9

摘要：目的 建立麥芽酚鋁致原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元損傷模型，探討DP2干預(yù)對(duì)鋁負(fù)荷原代海馬神經(jīng)元的作用。方法選取孕期18 d左右的SD大鼠，離體培養(yǎng)胎鼠海馬神經(jīng)元，d 7進(jìn)行NSE免疫組化鑒定，并給予Al（malt）3建立鋁負(fù)荷致原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元損傷模型，同時(shí)分別給予DP2激動(dòng)劑DK-PGD2和DP2拮抗劑CAY10471進(jìn)行干預(yù)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，檢測(cè)各組海馬神經(jīng)元MTT值、LDH漏出率和Ca2＋熒光強(qiáng)度，HE染色觀察神經(jīng)元病理形態(tài)變化。結(jié)果海馬神經(jīng)元純度超過95%。與空白對(duì)照組比較，鋁負(fù)荷模型組MTT值明顯降低（P＜0.01）；LDH漏出率明顯升高（P ＜0.01）；Ca2＋熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)（P＜0.01）；神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目明顯減少，突起萎縮甚至消失，部分細(xì)胞核固縮。與鋁負(fù)荷模型組比較，DP2激動(dòng)劑DK-PGD2干預(yù)組MTT值明顯降低（P＜0.01、P＜0.05）；LDH漏出率明顯升高（P＜0.01）；Ca2＋熒光強(qiáng)度有增強(qiáng)趨勢(shì)，但差異無顯著性；海馬神經(jīng)細(xì)胞幾乎全部核固縮、裂解。DP2拮抗劑CAY10471干預(yù)組MTT值明顯升高（P＜0.01）；LDH漏出率明顯降低（P＜0.01）；Ca2＋熒光強(qiáng)度明顯減弱（P＜0.01）。海馬神經(jīng)細(xì)胞胞體、胞核明顯，裂解細(xì)胞明顯減少。結(jié)論 DP2激活表達(dá)可增加神經(jīng)元對(duì)鋁鹽損傷的易感性。

關(guān)鍵詞：海馬神經(jīng)元；鋁負(fù)荷；DP2；Ca2＋；DK-PGD2；CAY10471

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－7－22 10：42 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．012．html

鋁為地殼中含量最豐富的金屬元素，人類日常生活中應(yīng)用廣泛，主要通過食物、化妝品及建筑材料等途徑攝入。經(jīng)證實(shí)，長期攝入大劑量鋁會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性，表現(xiàn)為行為和認(rèn)知功能障礙、神經(jīng)元損傷，甚至神經(jīng)退行性變，但其具體機(jī)制尚不完全清楚。

前列腺素（PGs）是一類多不飽和脂肪酸衍生物，由環(huán)氧化酶（COX）催化花生四烯酸（AA）代謝產(chǎn)生，介導(dǎo)一系列生理病理過程［1］。前列腺素D2（PGD2）是大腦中最豐富的PGs，其合酶（PGDS）有腦型PGDS（L-PGDS）和生血型PGDS（H-PGDS）兩種亞型［2］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，除少突膠質(zhì)細(xì)胞外，L-PGDS高表達(dá)于神經(jīng)元［3］。PGD2與特異性受體DP1和DP2結(jié)合后，通過受體介導(dǎo)的信號(hào)傳遞機(jī)制而發(fā)揮廣泛作用。DP1和DP2都是G蛋白偶聯(lián)受體，分別偶聯(lián)Gs和Gi蛋白，影響環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平而發(fā)揮不同作用。有研究報(bào)道，在PGD2致原代大鼠皮層神經(jīng)元損傷模型中，DP2拮抗劑BAY-u3405未發(fā)揮保護(hù)作用，推測(cè)DP2可能不介導(dǎo)PGD2的神經(jīng)毒性［4］。另也有研究報(bào)道，在谷氨酸致原代大鼠海馬腦片損傷模型中，DP2激動(dòng)劑DK-PGD2明顯升高神經(jīng)元的LDH漏出率及細(xì)胞死亡率，提示DP2介導(dǎo)PGD2的神經(jīng)毒性［5］。出現(xiàn)此矛盾結(jié)果，可能與研究模型不同有關(guān)。DP2作為DP受體中的一員，在鋁鹽致原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元損傷過程中具體是如何變化的，尚未見報(bào)道。目前廣泛研究的DP2選擇性激動(dòng)劑主要有DK-PGD2、15d-PGD2、15d-PGJ2，DP2選擇性拮抗劑主要有CAY10471、AM-461、AZD1981。參考Yue等［6］的報(bào)道，我們選擇DK-PGD2、CAY10471作為干預(yù)藥物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鋁負(fù)荷原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元損傷模型中，L-PGDS表達(dá)明顯上調(diào)，DP2表達(dá)明顯下調(diào)，PGD2含量明顯升高，初步提示L-PGDS-PGD2-DP2信號(hào)通路可能參與了神經(jīng)元損傷過程。在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用DP2選擇性激動(dòng)劑和拮抗劑分別干預(yù)鋁負(fù)荷神經(jīng)元，進(jìn)一步觀察DP2在原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元中的作用。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取孕期18 d左右的SD大鼠，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證書號(hào)：SCXK（渝）2012－0002。

1．1．2主要試劑與儀器 麥芽酚（阿拉丁，上海），DMEM／F12、D-Hank′s（Hyclone，美國），B27、Neuro-basal培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco，美國），左旋多聚賴氨酸、MTT試劑盒（Sigma，美國），青霉素－鏈霉素溶液、LDH試劑盒、Fluo-3 AM（碧云天，上海），山羊抗兔特異性烯醇化酶（NSE）多克隆抗體（博士德，武漢），SP試劑盒、DAB顯色劑（中杉金橋，北京），蘇木精染液、伊紅染液（南京建成，南京），DK-PGD2、CAY10471（Cayman，美國），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Sci-entific，美國），超純水系統(tǒng)（Millipore，美國），低溫冷凍離心機(jī)（Thermo Scientific，美國），激光掃描共聚焦顯微鏡（Bio-Rad，美國），全自動(dòng)酶標(biāo)儀（BioTek，美國）。

1．2方法

1．2．1大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng) 取孕期18 d左右的SD大鼠，斷頸后迅速剪開腹部皮膚和腹膜，將子宮完全暴露后剪斷肌層和臍帶，取出胎鼠并立即浸泡于裝有75%乙醇的燒杯中。約30 s后，將消毒好的胎鼠移入事先準(zhǔn)備的D-Hanks液中，斷頭取腦，迅速分離出兩側(cè)完整海馬，放入冰浴的D-Hanks液中，用眼科剪將海馬組織剪碎。加入組織體積5倍左右的0.125%胰酶，混勻，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化，10 min時(shí)拿出輕輕吹打數(shù)次。20 min后，加入同體積的含10%胎牛血清培養(yǎng)液終止消化。200目細(xì)胞網(wǎng)篩過濾，收集細(xì)胞懸液，800 r·min－1離心10 min。棄去上清，加入一定量的含10%胎牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，制成細(xì)胞密度為1×106·L－1的細(xì)胞懸液。吸取不同體積細(xì)胞懸液分別接種于左旋多聚賴氨酸包被好的培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿及培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h后，待神經(jīng)元貼壁，換含2%B27的Neurobasal培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，以后每隔3 d半量換液1次。海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至d 7時(shí)長到較好狀態(tài)，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)［7］。

1．2．2原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元的免疫化學(xué)鑒定

取6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)至d 7的海馬神經(jīng)元爬片（10 mm×10 mm），棄去細(xì)胞培養(yǎng)液用PBS漂洗3次；4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3次，每次2 min；3%H2O2孵育15 min，PBS漂洗3次，每次2 min；10%山羊血清封閉，37℃孵育20 min，吸干血清，不漂洗；NSE多克隆抗體∶抗體稀釋液（1∶50），以PBS代替一抗設(shè)空白對(duì)照，4℃孵育過夜，PBS漂洗3次，每次5 min；生物素標(biāo)記山羊抗兔二抗，37℃孵育30 min，PBS漂洗3次，每次5 min；辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵蛋白素工作液，37℃孵育30 min，PBS漂洗3次，每次5 min；避光條件下，DAB顯色10 min，自來水終止反應(yīng)；蘇木精染液復(fù)染細(xì)胞核，3 min后自來水返藍(lán)；95%乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；晾干，鏡下觀察［8］。

1．2．3MTT測(cè)定 將96孔培養(yǎng)板中大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至d 7進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組，即空白對(duì)照組（300 μmol·L－1maltol）、鋁負(fù)荷模型組［100 μmol·L－1Al（malt）3］、干預(yù)組（Al3＋＋10－5、3×10－6、10－6mol ·L－1DK-PGD2、CAY10471）。在加入處理因素后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μL的MTT溶液（5 g· L－1），37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h。棄去孔內(nèi)上清液，加入150 μL DMSO，搖床上避光震蕩，以充分溶解結(jié)晶物，于570 nm波長處測(cè)定吸光度值（OD值）。

1．2．4乳酸脫氫酶（LDH）漏出率測(cè)定 將24孔培養(yǎng)板中大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至d 7進(jìn)行實(shí)驗(yàn)藥物處理（分組同“1．2．3”），繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，根據(jù)LDH測(cè)定試劑盒說明書具體步驟操作，于490 nm波長處測(cè)定OD值。計(jì)算公式：細(xì)胞毒性或LDH漏出率／%＝（處理樣品OD值－樣品對(duì)照孔OD值）／（細(xì)胞最大酶活性的OD值－樣品對(duì)照孔OD值）×100。

1．2．5海馬神經(jīng)元病理形態(tài)學(xué)觀察 將24孔培養(yǎng)板中大鼠海馬神經(jīng)元爬片（10 mm×10 mm）培養(yǎng)至d 7進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組，即空白對(duì)照組（300 μmol·L－1mal-tol）、鋁負(fù)荷模型組［100 μmol·L－1Al（malt）3］、干預(yù)組（Al3＋＋10－5mol·L－1DK-PGD2、CAY10471）。在加入處理因素后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS漂洗3次，每次1 min；4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3次；HE染色，鏡下觀察。

1．2．6Ca2＋熒光強(qiáng)度測(cè)定 將共聚焦專用培養(yǎng)皿中大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至d 7進(jìn)行藥物處理（分組同“1．2．5”），繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液，采用Ca2＋熒光探針Fluo-3／AM標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)Ca2＋，通過激光掃描共聚焦顯微鏡測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Ca2＋熒光強(qiáng)度。

2　結(jié)果

2．1原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元NSE免疫化學(xué)鑒定

培養(yǎng)至d 7的神經(jīng)元，在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察，其胞體飽滿有光暈，軸突和樹突明顯，突起交錯(cuò)連接成網(wǎng)狀。經(jīng)NSE免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，陽性細(xì)胞胞體及突起呈棕黃色；蘇木精復(fù)染后，陽性細(xì)胞胞核呈藍(lán)色。隨機(jī)取6個(gè)視野，每個(gè)視野挑選100個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)NSE陽性細(xì)胞并計(jì)算其所占百分比。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，超過95%為陽性細(xì)胞（Fig 1）。

Fig 1 NSE expression in primary cultured rat hippocampal neuron by immunocytochemistry

2．2DP2干預(yù)對(duì)鋁負(fù)荷原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元存活力的影響

2．2．1DK-PGD2對(duì)鋁負(fù)荷原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元存活力的影響 與空白對(duì)照組比較，鋁負(fù)荷模型組MTT值明顯降低（P＜0.01）；與鋁負(fù)荷模型組比較，DK-PGD2干預(yù)組MTT值明顯降低，且有劑量依賴性（Tab 1）。

Tab 1 Effects of DK-PGD2on viability of primary cultured rat hippocampal neuron treated with aluminum overload（±s，n＝6）

Tab 1 Effects of DK-PGD2on viability of primary cultured rat hippocampal neuron treated with aluminum overload（±s，n＝6）

＃＃P＜0．01 vs control；*P＜0.05，**P＜0．01 vs 100 μmol·L－1Al（malt）3

Group OD Control　0．63±0．02 100 μmol·L－1Al（malt）3　0．40±0．03＃＃Al3＋＋10－5mol·L－1DK-PGD2　0．21±0．01**Al3＋＋3×10－6mol·L－1DK-PGD2　0．25±0．02**Al3＋＋10－6mol·L－1DK-PGD2　0．33±0．02*

2．2．2CAY10471對(duì)鋁負(fù)荷原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元存活力的影響 與空白對(duì)照組比較，鋁負(fù)荷模型組MTT值明顯降低（P＜0.01）；與鋁負(fù)荷模型組比較，CAY10471干預(yù)組MTT值明顯升高，且有劑量依賴性（Tab 2）。

2．3DP2干預(yù)對(duì)鋁負(fù)荷原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元LDH漏出率的影響

Tab 2 Effects of CAY10471 on viability of primary cultured rat hippocampal neuron treated with aluminum overload（±s，n＝6）

Tab 2 Effects of CAY10471 on viability of primary cultured rat hippocampal neuron treated with aluminum overload（±s，n＝6）

＃＃P＜0．01 vs control；**P＜0．01 vs 100 μmol·L－1Al（malt）3

Group OD Control　0．85±0．03 100 μmol·L－1Al（malt）3　0．51±0．03＃＃Al3＋＋10－5mol·L－1CAY10471　0．76±0．04**Al3＋＋3×10－6mol·L－1CAY10471　0．67±0．04**Al3＋＋10－6mol·L－1CAY10471　0．58±0．04**

2．3．1DK-PGD2對(duì)鋁負(fù)荷原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元LDH漏出率的影響 與空白對(duì)照組比較，鋁負(fù)荷模型組LDH漏出率明顯升高（P＜0.01）；與鋁負(fù)荷模型組比較，DK-PGD2干預(yù)組LDH漏出率明顯升高，10－5mol·L－1、3×10－6mol·L－1組差異有顯著性（P＜0.01）（Tab 3）。

Tab 3 Effects of DK-PGD2on LDH leakage of primary cultured rat hippocampal neuron treated with aluminum overload（±s，n＝6）

Tab 3 Effects of DK-PGD2on LDH leakage of primary cultured rat hippocampal neuron treated with aluminum overload（±s，n＝6）

＃＃P＜0．01 vs control；**P＜0．01 vs 100 μmol·L－1Al（malt）3

Group　LDH leakage／% Control　4．03±0．34 100 μmol·L－1Al（malt）3　21．90±0．89＃＃Al3＋＋10－5mol·L－1DK-PGD2　43．38±1．56**Al3＋＋3×10－6mol·L－1DK-PGD2　31．41±1．97**Al3＋＋10－6mol·L－1DK-PGD223．23±0．56

2．3．2CAY10471對(duì)鋁負(fù)荷原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元LDH漏出率的影響 與空白對(duì)照組比較，鋁負(fù)荷模型組LDH漏出率明顯升高（P＜0.01）；與鋁負(fù)荷模型組比較，CAY10471干預(yù)組LDH漏出率明顯降低（P＜0.01）（Tab 4）。

Tab 4 Effects of CAY10471 on LDH leakage of primary cultured rat hippocampal neuron treated with aluminum overload（±s，n＝6）

Tab 4 Effects of CAY10471 on LDH leakage of primary cultured rat hippocampal neuron treated with aluminum overload（±s，n＝6）

＃＃P＜0．01 vs control；**P＜0．01 vs 100 μmol·L－1Al（malt）3

Group　LDH leakage／% Control　5．50±0．94 100 μmol·L－1Al（malt）3　35．19±2．03＃＃Al3＋＋10－5mol·L－1CAY10471　7．40±1．36**Al3＋＋3×10－6mol·L－1CAY10471　20．63±1．41**Al3＋＋10－6mol·L－1CAY10471　27．68±1．51**

2．4DP2干預(yù)對(duì)鋁負(fù)荷原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元病理形態(tài)學(xué)的影響 HE染色后，在正置光學(xué)顯微鏡下觀察，空白對(duì)照組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清晰完整，胞體呈錐形或三角形，核仁明顯，有雙極或多極突起并相互交織成網(wǎng)；鋁負(fù)荷模型組海馬神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目明顯減少，突起萎縮，部分細(xì)胞核固縮；DK-PGD2干預(yù)組海馬神經(jīng)細(xì)胞幾乎全部核固縮、裂解；CAY10471干預(yù)組海馬神經(jīng)元較模型組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，胞體、胞核明顯，裂解細(xì)胞明顯減少（Fig 2、3）。

Fig 2 Effects of DK-PGD2inter-vention on pathomorphology of primary cultured rat hippocampal neuron treated with aluminum overload（×400）

Fig 3 Effects of CAY10471 in-tervention on pathomorphology of primary cultured rat hippocampal neuron treated with aluminum o-verload（×400）

2．5DP2干預(yù)對(duì)鋁負(fù)荷原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元Ca2＋熒光強(qiáng)度變化的影響 空白對(duì)照組海馬神經(jīng)元的Ca2＋熒光強(qiáng)度極其微弱，鋁負(fù)荷模型組Ca2＋熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)（P＜0.01）；與鋁負(fù)荷模型組比較，DK-PGD2干預(yù)組Ca2＋熒光強(qiáng)度有增強(qiáng)趨勢(shì)，但差異無顯著性；CAY10471干預(yù)組Ca2＋熒光強(qiáng)度明顯降低（P＜0.01）（Tab 5、Fig 4）。

Tab 5 Effects of DP2intervention on Ca2＋fluorescence intensity change of primary cultured rat hippocampal neuron treated with aluminum overload（±s，n＝10）

Tab 5 Effects of DP2intervention on Ca2＋fluorescence intensity change of primary cultured rat hippocampal neuron treated with aluminum overload（±s，n＝10）

＃＃P＜0．01 vs control；**P＜0．01 vs 100 μmol·L－1Al（malt）3

Group　Fluorescence intensity Control　295．77±46．45 100 μmol·L－1Al（malt）3　2 039．90±138．26＃＃Al3＋＋10－5mol·L－1DK-PGD2　2 219．96±138．10 Al3＋＋10－5mol·L－1CAY10471　1 062．11±161．40**

3　討論

鋁作為一種公認(rèn)的神經(jīng)毒劑，過量蓄積可嚴(yán)重影響人的認(rèn)知功能，進(jìn)而誘發(fā)一系列神經(jīng)系統(tǒng)疾病［9］。與三氯化鋁、葡萄糖酸鋁等其他鋁鹽相比，麥芽酚鋁［Al（malt）3］是一種中性含鋁復(fù)合物，在生理pH條件能釋放出大量Al3＋，有利于進(jìn)行鋁負(fù)荷神經(jīng)毒性的相關(guān)研究［10］。本實(shí)驗(yàn)采用Neurobasal培養(yǎng)基（含2%B27）進(jìn)行海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)，通過神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)特異性標(biāo)志物NSE的鑒定，其純度超過95%。參考Chen等［11］并通過我們的前期實(shí)驗(yàn)摸索，本實(shí)驗(yàn)采用100 μmol·L－1麥芽酚鋁建立鋁負(fù)荷大鼠原代海馬神經(jīng)元損傷模型。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，鋁負(fù)荷原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元MTT值明顯降低、LDH漏出率明顯升高、Ca2＋熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目明顯減少、突起萎縮，部分細(xì)胞核固縮。Chen等［12］對(duì)麥芽酚鋁致原代培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元損傷進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)Al3＋通過激活Rho-Rock信號(hào)通路誘導(dǎo)神經(jīng)毒性。Johnson等［13］在原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)，麥芽酚鋁可造成神經(jīng)元呈時(shí)間和劑量依賴性凋亡，其作用機(jī)制可能與麥芽酚鋁抑制腦源性神經(jīng)生長因子（BDNF），導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2＋升高有關(guān)。

Fig 4 Effects of DP2intervention on Ca2＋fluorescence intensity change of primary cultured rat hippocampal neuron treated with aluminum overload（×200）

我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，與鋁負(fù)荷模型組相比，DK-PGD2干預(yù)組MTT值明顯降低、LDH漏出率明顯升高、Ca2＋熒光強(qiáng)度有增強(qiáng)趨勢(shì)，海馬神經(jīng)細(xì)胞幾乎全部核固縮、裂解；CAY10471干預(yù)組MTT值明顯升高、LDH漏出率明顯降低、Ca2＋熒光強(qiáng)度明顯減弱，海馬神經(jīng)元較模型組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，胞體、胞核明顯，裂解細(xì)胞明顯減少。有研究報(bào)道［14］，DP2偶聯(lián)Gi蛋白，通過激活磷脂酰肌醇3激酶（PI3K），磷酸化絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶（Ser50／Thr145），激活糖原合成酶3（GSK-3），活化T細(xì)胞核因子的轉(zhuǎn)換，釋放炎性介質(zhì)。也有研究報(bào)道［15］，DP2被激活后偶聯(lián)Gi蛋白，抑制cAMP水平，促進(jìn)Ca2＋內(nèi)流，上調(diào)CD11b表達(dá)，誘導(dǎo)嗜堿性粒細(xì)胞遷移和脫顆粒，促進(jìn)IL-2、IL-4、IL-5、IL-13的釋放。Liang等［5］對(duì)天冬氨酸（NMDA）致原代海馬神經(jīng)元損傷進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)DK-PGD2加重神經(jīng)元損傷。Schroder等［16］對(duì)炎性相關(guān)因子前列腺素H1（PGH1）進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)CAY10471可抑制Th2細(xì)胞的遷移。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，DK-PGD2可能通過激動(dòng)DP2，偶聯(lián)Gi蛋白，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度，加重鋁負(fù)荷原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元損傷；CAY10471可能通過抑制DP2活性，減少Ca2＋流入，對(duì)鋁負(fù)荷原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元損傷起一定保護(hù)作用。

綜上所述，DP2激活表達(dá)可增加神經(jīng)元對(duì)鋁鹽損傷的易感性，其機(jī)制可能涉及DP2下游Ca2＋信號(hào)通路的調(diào)控，但由于作用復(fù)雜，在神經(jīng)系統(tǒng)中的機(jī)制尚不完全清楚。因此，在本研究的基礎(chǔ)上，可對(duì)DP2在神經(jīng)系統(tǒng)中介導(dǎo)的下游Ca2＋信號(hào)通路的具體調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究。

（致謝：本實(shí)驗(yàn)在重慶醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，非常感謝實(shí)驗(yàn)室提供的優(yōu)越實(shí)驗(yàn)條件，使得本實(shí)驗(yàn)?zāi)茼樌瓿伞Ｔ俅纬噬衔艺\摯的謝意！）

參考文獻(xiàn)：

［1］ Hao C M，Breyer M D．Physiologic and pathophysiologic roles of lipid mediators in the kidney［J］．Kidney Int，2007，71（11）：1105－15．

［2］ Urade Y，Hayaishi O．Biochemical，structural，genetic，physio-logical，and pathophysiological features of lipocalin-type prosta-glandin D synthase［J］．Biochim Biophys Acta，2000，1482（1－2）：259－71．

［3］ Medani M，Collins D，Mohan H M，et al．Prostaglandin D2regu-lates human colonic ion transport via the DP1receptor［J］．Life Sci，2015，122（2）：87－91．

［4］ Liu H，Li W，Rose M E，et al．Prostaglandin D2toxicity in pri-mary neurons is mediated through its bioactive cyclopentenone me- tabolites［J］．Neurotoxicology，2013，39（12）：35－44．

［5］ Liang X，Wu L，Hand T，et al．Prostaglandin D2mediates neuro-nal protection via the DP1receptor［J］．J Neurochem，2005，92 （3）：477－86．

［6］ Yue L，Haroun S，Parent J L，et al．Prostaglandin D（2）induces apoptosis of human osteoclasts through ERK1／2 and Akt signaling pathways［J］．Bone，2014，60（3）：112－21．

［7］ Liu X，Chen B，Chen L，et al．U-shape suppressive effect of phe-nol red on the epileptiform burst activity via activation of estrogen receptors in primary hippocampal culture［J］．PLoS One，2013，8 （4）：e60189．

［8］ 黃 硯，楊俊卿，謝靈瑤．咖啡酸對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元鋁鹽損傷的保護(hù)作用［J］．中國藥理學(xué)通報(bào)，2009，25（12）：1605－9．

［8］ Huang Y，Yang J Q，Xie L Y．Protective effect of caffeicacid on damage induced by aluminum-overload in primary cultured rat hip-pocampal neuron［J］．Chin Pharmacol Bull，2009，25（12）：1605 －9．

［9］ Molloy D W，Standish T I，Nieboer E，et al．Effects of acute ex-posure to aluminum on cognition in humans［J］．J Toxicol Environ Health A，2007，70（23）：2011－9．

［10］Bharathi，Shamasundar N M，Sathyanarayana Rao T S，et al．A new insight on Al-maltolate-treated aged rabbit as Alzheimer′s ani-mal model［J］．Brain Res Rev，2006，52（2）：275－92．

［11］Chen T J，Cheng H M，Wang D C，et al．Nonlethal aluminum malto-late can reduce brain-derived neurotrophic factor-induced Arc ex-pression through interrupting the ERK signaling in SH-SY5Y neuro-blastoma cells［J］．Toxicol Lett，2011，200（1-2）：67－76．

［12］Chen T J，Hung H S，Wang D C，et al．The protective effect of Rho-associated kinase inhibitor on aluminum-induced neurotoxicity in rat cortical neurons［J］．Toxicol Sci，2010，116（1）：264－72．

［13］Johnson V J，Kim S H，Sharma R P．Aluminum-maltolate induces apoptosis and necrosis in neuro-2a cells：potential role for p53 sig-naling［J］．Toxicol Sci，2005，83（2）：329－39．

［14］Hata A N，Breyer R M．Pharmacology and signaling of prostaglan-din receptors：multiple roles in inflammation and immune modula-tion［J］．Pharmacol Ther，2004，103（2）：147－66．

［15］Arima M，F(xiàn)ukuda T．Prostaglandin D（2）and T（H）2 inflamma-tion in the pathogenesis of bronchial asthma［J］．Korean J Intern Med，2011，26（1）：8－18．

［16］Schroder R，Xue L，Konya V，et al．PGH1，the precursor for the anti-inflammatory prostaglandins of the 1-series，is a potent activa-tor of the pro-inflammatory receptor CRTH2／DP2［J］．PLoS One，2012，7（3）：e33329．

Effects of DP2intervention on primary cultured rat hippocampal neuron treated with aluminum overload

YANG Qun-fang，WEI Yu-ling，YANG Jun-qing
（Dept of Pharmacology，Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Pharmacology，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

Abstract：Aim To establish primary cultured rat hip-pocampal neuron damage model induced by aluminum maltolate and study the effect of intervention for DP2on primary cultured rat hippocampal neuron treated withbook=1076,ebook=45aluminum overload．Methods The hippocampus was dissected out from fetal rat（embryonic 18 d）．After being cultured for 7 d，the hippocampal neuron was treated with Al（malt）3to establish the model of prima-ry cultured rat hippocampal neuron damage and mean-while treated with DP2agonist DK-PGD2and DP2an-tagonist CAY10471，respectively．After treatment for 24 h，the cell viability was measured by MTT and LDH，Ca2＋fluorescence intensity．Neuronal pathomor-phology was observed by HE staining．Results The purity of hippocampal neuron was more than 95%．Compared with the control group，the number of hipp-ocampal neurons was reduced and neurons became chromatic agglutination and karyopyknosis in aluminum overload group．Treatment of aluminum caused a sig-nificant decrease in MTT value（P＜0.01）and an in- crease in the LDH leakage rate（P＜0.01）．The Ca2＋fluorescence intensity significantly increased（P＜0.01）in aluminum overload group．Compared with that of the aluminum overload group，treatment of DK-PGD2，a selective DP2agonist，significantly aggravated the primary cultured rat hippocampal neuron injury caused by aluminum overload accompanied with the significant decrease of MTT value（P＜0.01，P＜0.05）and an increase of the LDH leakage rate（P＜0.01），significant increase of Ca2＋fluorescence inten-sity of neuron．Treatment of CAY10471，a selective DP2antagonist，had opposite effects of DK-PGD2．Conclusion The activation of DP2can increase hipp-ocampal neural susceptibility to aluminum overload．

Key words：hippocampal neuron；aluminum overload；DP2；Ca2＋；DK-PGD2；CAY10471

作者簡介：陽群芳（1989－），女，碩士生，研究方向：神經(jīng)精神藥理學(xué)，E-mail：yqfang0817＠163．com；楊俊卿（1968－），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)精神藥理學(xué)，通訊作者，Tel：023-68485161，E-mail：qqqjy＠sohu．com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 81070972）

收稿日期：2015－03－11，修回日期：2015－04－14

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）08－1071－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．009