慢性間歇性低壓低氧抑制線粒體途徑介導的代謝綜合征大鼠心肌組織細胞凋亡

袁 芳，李艷青，滕 旭，3，周京京，郭 贊，王 昕，張自偉，張 翼

(1.河北醫科大學生理學教研室，河北石家莊 050017;2.河北省中醫院婦科，河北 石家莊 050011;3.河北省重點實驗動物實驗室，河北石家莊 050017;4.河北醫科大學第一醫院，河北石家莊 050030)

代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)包括肥胖、胰島素抵抗、血脂異常、血壓升高和葡萄糖耐受不良等在內的一系列危險因素。MS中的任何一個因素都可能引起心臟病變，而上述因素的聯合作用還可能進一步增加風險［1］。MS能夠使冠心病的發病率增加2倍，死亡率增加3倍［2］。越來越多的證據表明，MS能夠同時導致心臟結構和功能的惡化，最終發展成為心力衰竭。而包括心肌細胞凋亡在內的心肌結構病理性改變是導致心功能降低，并最終發展成為心力衰竭的重要病理機制［3］。因此，如何通過改善心肌細胞凋亡，進而治療MS患者心功能異常已成為重要的研究靶點和策略。

慢性間歇性低壓低氧(chronic intermittent hypobaric hypoxia，CIHH)是指間斷性的模擬高海拔的低壓低氧，在兩次低壓低氧之間恢復常壓常氧［4］。我實驗室前期研究證實CIHH具有明顯的心血管保護作用，改善心肌缺血/再灌注損傷導致的心功能降低和心律失常的發生。我們前期通過Langendorff心臟離體灌流實驗證實，果糖喂養誘導的MS大鼠缺血后在再灌注過程中心功能明顯降低，而CIHH能夠明顯改善果糖喂養大鼠心功能的下降［5］。但是，CIHH對MS大鼠心肌細胞凋亡的影響及其機制目前仍不清楚。因此，本實驗目的在于證實CIHH能夠改善MS大鼠的心肌細胞凋亡，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 MS模型制備和CIHH處理 ♂，體質量250～300 g，Sprague-Dawley(SD)大鼠(河北醫科大學動物中心)隨機分為4組:對照組(control)、果糖(fructose，F)組、CIHH 組、果糖 +CIHH(CIHH-F)組。需要果糖喂養的大鼠飲用質量濃度為100 g·L－1的果糖，共喂養42 d。CIHH組大鼠每天8∶00 am置于低壓低氧艙內，給予模擬海拔5 000 m(PO2=11.2 kPa)的處理，每天持續6 h，其余時間將大鼠置于飼養室內(常壓常氧)，共給予42 d的間歇性低壓低氧處理。CIHH-F組大鼠同時進行果糖喂養和CIHH處理。所有大鼠自由飲食，每天計算飲水量，每周稱量體重1次。

1.2 血壓測量 使用鼠尾動脈壓測量裝置(LE5001，pressure meter，Panlab)，每周測量清醒大鼠鼠尾動脈收縮壓(systolic arterial pressure，SAP)1次。每只大鼠每次測量重復3次，取平均值。實驗滿42 d后，饑餓大鼠12 h，經頸總動脈插管測量大鼠的動脈血壓。測量結束后處死大鼠，分別取血和心臟進行相應指標監測。

1.3 血漿生化指標檢測 大鼠血液經抗凝離心(3 000 r·min－1，15 min)后取上層血漿，用以檢測血漿葡萄糖(葡萄糖氧化法，北京科美東雅生物技術有限公司產品)、膽固醇(膽固醇酯酶法，山東3V生物工程有限公司產品)、甘油三酯(甘油三酯水解酶法，山東3V生物工程有限公司產品)和胰島素(ELISA，北京北方生物技術研究所產品)含量。

1.4 心肌組織HE染色和TUNEL染色 心肌組織經4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片(厚度6 μm)，HE染色后觀察心肌組織結構變化。TUNEL染色觀察心肌細胞凋亡情況，操作依據TUNEL試劑盒(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)說明書進行。

1.5 心肌組織caspase-3活性測定 取心肌組織約20 mg勻漿，Bradford法測定蛋白濃度，酶標法檢測caspase-3活性(106U·g－1protein)。詳細操作按照caspase-3活性測定試劑盒(碧云天生物技術研究所)說明書進行。

1.6 心肌組織Western blot 取心肌組織約50 mg勻漿，提取總蛋白，Western blot檢測Bcl-2、Bax以及β-actin的蛋白表達。簡要過程為:將提取的心肌組織蛋白進行蛋白定量(Bradford法)后，十二烷基硫酸鈉－聚丙稀酰胺凝膠電泳，硝酸纖維素膜轉膜，脫脂奶粉封閉，一抗4℃ 孵育過夜(兔抗Bcl-2和兔抗Bax購自Santa Cruz公司;兔抗β-actin購自GeneTex公司)，TBST清洗3次，二抗(購自GeneTex公司)室溫孵育1 h，發光，掃描儀掃描膠片，保存圖片。應用NIH image軟件對圖片中條帶進行灰度測量，Bcl-2和Bax的相對表達量為其條帶灰度與β-actin條帶灰度之比。

2 結果

2.1 CIHH明顯改善果糖喂養大鼠的MS一般特征和心臟改變 與對照組大鼠相比，F組大鼠空腹血漿胰島素、胰島素C肽(C peptide，C-p)、葡萄糖、膽固醇和甘油三酯明顯升高(Fig 1，P＜0.05)。而CIHH-F組大鼠上述血漿生化指標的異常明顯改善(Fig 1，P＜0.05)。CIHH組血漿生化指標與對照組大鼠差異無顯著性(Fig 1，P＞0.05)。

Fig 1 Effect of CIHH on blood biochemicals in fructose-fed rats(±s，n=6)

F組大鼠較對照組大鼠收縮壓、體重指數、心重/體重和左室重/心重明顯升高。而CIHH-F組大鼠上述指標明顯改善。與對照組大鼠相比，CIHH組大鼠上述指標差異無顯著性(Tab 1)。

Tab 1 Effect of CIHH on body mass index，systolic arterial blood pressure and heart weight in fructose-fed rats(±s，n=6)

Tab 1 Effect of CIHH on body mass index，systolic arterial blood pressure and heart weight in fructose-fed rats(±s，n=6)

CIHH:Chronic intermittent hypobaric hypoxia treated group;Fructose:Fructose treated group;CIHH-F:CIHH and fructose treated group;HW/BW:Ratio of total heart weight to body weight;LVW/THW:Ratio of left ventricular weight plus inter-ventricular septum weight to total heart weight.*P ＜0.05 vs control rats;#P ＜0.05 vs fructose group.

Groups Body mass index/kg·m －2 SAP/kPa HW/BW/mg·g－1 LVW/HW/g·g －1 Control 6.3 ±0.02 15.5 ±0.64 4.32 ±0.15 0.78 ±0.01 Fructose 7.0 ±0.02* 20.4 ±0.90*4.77 ±0.13*0.85 ±0.02*CIHH 6.1 ±0.03#15.0 ±0.93#4.26 ±0.17#0.77 ±0.02#CIHH-F 6.3 ±0.02#15.2 ±1.13#4.35 ±0.18#0.79 ±0.02#

HE染色結果顯示，對照組和CIHH組大鼠心肌細胞排列整齊，未見明顯的變性、壞死和炎癥細胞浸潤等。F組大鼠心肌細胞水腫，排列紊亂，細胞之間間隙增寬，結締組織增多。而CIHH-F組大鼠心肌結構損傷較F組大鼠明顯改善(Fig 2)。

Fig 2 Histological analysis of hearts of control，CIHH，fructosefed and CIHH-F groups(200×)(±s，n=6)

2.2 CIHH明顯改善果糖喂養大鼠的心肌細胞凋亡 TUNEL染色顯示，對照組和CIHH組大鼠僅見少量、散在的凋亡心肌細胞。F組大鼠凋亡心肌細胞數量明顯增加，而CIHH-F組大鼠凋亡心肌細胞數量較F組大鼠明顯降低(Fig 3 A，B)。

caspase-3活性檢測同樣顯示，與對照組相比，F組大鼠心肌caspase-3活性明顯升高。CIHH能夠明顯抑制果糖誘導的caspase-3活性升高。而單純CIHH組心肌caspase-3活性與對照組無差別(Fig 3C)。

Fig 3 Effect of CIHH on apoptosis in fructose-fed rats

2.3 CIHH可能通過上調Bcl-2/Bax比值抑制心肌細胞凋亡 Western blot結構顯示，與對照組大鼠相比，F組大鼠心肌組織Bcl-2蛋白表達明顯下調，Bax蛋白表達明顯上調，Bcl-2/Bax比值明顯降低。CIHH能夠明顯改善果糖喂養導致的上述蛋白的表達改變。而單純CIHH和對照組相比，上述蛋白表達和比值無明顯差異(Fig 4)。

Fig 4 Protein expression of Bcl-2 and Bax in myocardium detected by Western blot

3 討論

我們利用果糖喂養誘導的大鼠MS模型證實，CIHH能夠明顯改善MS大鼠的相關癥狀，包括高血壓、高血糖、血脂紊亂和胰島素抵抗等。而且，CIHH能夠明顯改善MS大鼠的心肌細胞凋亡，其機制可能是通過抑制線粒體途徑發揮改善心肌細胞凋亡的作用。上述結果可能為MS患者心肌損傷的預防和治療提供新的靶點和思路。

由于富含果糖飲料的消費增加，人們日常攝入的果糖量相應增加。而越來越多的研究證實高果糖攝入量是促進MS發生發展的關鍵因素之一。果糖喂養的大鼠能夠誘導出與人MS及其相似的病理生理改變，包括胰島素抵抗、體重增加、高脂血癥、高胰島素血癥、高甘油三脂血癥、葡萄糖耐量降低、高血壓、心功能異常和心力衰竭等［6］。本實驗中，我們應用10%果糖水喂養大鼠42 d同樣成功誘導出MS的相應表現，如高血壓、高血糖、高甘油三脂血癥、高膽固醇血癥和高胰島素血癥等。上述結果提示，通過果糖喂養制備大鼠MS模型是可行的，能夠成功誘導出MS的相關病理生理表現。

心肌損傷和心功能異常是MS的重要并發癥之一，并最終導致患者的死亡率增加［1］。肥胖飲食誘導的MS大鼠心功能明顯降低，電鏡觀察顯示心肌纖維排列紊亂、線粒體水腫，天狼星紅染色顯示間質纖維化明顯增加［7］。高脂飲食+25%果糖水喂養的MS大鼠同樣表現出心功能的抑制，以及心肌炎癥細胞浸潤和膠原纖維沉積增加［8］。單純應用高果糖飼料(50%果糖濃度)喂養的MS大鼠，心肌HE染色顯示心肌結構紊亂、組織間隙明顯增寬，TUNEL染色顯示左室心肌凋亡細胞數明顯增加［3］。我們的實驗結果同樣顯示，10%果糖水喂養大鼠的心肌組織表現出明顯的結構損傷，細胞水腫、排列紊亂、間隙增寬和結締組織增多，凋亡的心肌細胞數量明顯增加。而上述心肌組織的病理變化和細胞凋亡可能是導致心功能降低的重要原因。

越來越多的研究顯示，CIHH具有明顯的心血管調節和保護作用。CIHH能夠明顯改善缺血誘導的心肌細胞L型鈣電流峰值的降低［9］，抑制右心室乳頭肌β-腎上腺素能受體活性［10］，從而發揮心血管保護作用。此外，CIHH能夠明顯改善正常和MS大鼠缺血/再灌注誘導的心功能降低和細胞凋亡［5，11］。本實驗中，我們進一步證實，CIHH能夠明顯改善果糖喂養導致的的大鼠心肌細胞凋亡。CIHH改善心肌細胞凋亡的作用可能是其發揮心血管保護作用的重要機制之一。

線粒體途徑是誘導心肌細胞凋亡的重要途徑之一。Bcl-2家族是調節細胞凋亡線粒體途徑的關鍵因子。根據功能，Bcl-2家族成員可分為兩類:一類是細胞凋亡的抑制因子，例如Bcl-2、Bcl-Xl等;另一類是細胞凋亡的促進因子，例如Bax、Bak和Bad等。其中，Bcl-2和Bax及其比值是應用最多的研究細胞凋亡的指標。已有的研究發現，CIHH能夠改善缺血/再灌注導致的大鼠心肌Bcl-2的表達下調，同時抑制Bax的表達上調，通過抑制線粒體途徑改善心肌細胞凋亡，進而減輕心肌缺血/再灌注損傷［11］。本研究中同樣發現，果糖喂養的MS大鼠心肌組織Bcl-2表達下調，Bax表達上調，Bcl-2/Bax比值明顯降低，而CIHH能夠明顯改善上述指標的變化。上述結果提示，CIHH可能通過抑制線粒體途徑改善心肌細胞的凋亡。

此外，其它的研究和本文都發現CIHH在改善異常的心功能和細胞凋亡時，對正常的心功能和細胞凋亡水平并沒有明顯的影響［5，11］。這些實驗結果提示，CIHH的主要作用是維持體內結構和功能的穩態，而不是對某一生理功能或病理生理過程進行單向的調節，即單純的增強或者減低某一功能或病理生理過程。而其具體的調節作用及詳細機制仍需進行深入細致的研究。

［1］Ilkun O，Boudina S.Cardiac dysfunction and oxidative stress in the metabolic syndrome:an update on antioxidant therapies［J］.Curr Pharm Des，2013，19(27):4806－17.

［2］Nisoli E，Clementi E，Carruba M O，Moncada S.Defective mitochondrial biogenesis:a hallmark of the high cardiovascular risk in the metabolic syndrome［J］?Circ Res，2007，100(6):795 －806.

［3］Cheng S M，Cheng Y J，Wu L Y，et al.Activated apoptotic and anti-survival effects on rat hearts with fructose induced metabolic syndrome［J］.Cell Biochem Funct，2014，32(2):133 －41.

［4］Zhang Y，Zhou Z N.Beneficial effects of intermittent hypobaric hypoxia on the body［J］.Chin J Appl Physiol，2012，28(6):504－9.

［5］Zhou J J，Wei Y，Zhang L，et al.Chronic intermittent hypobaric hypoxia prevents cardiac dysfunction through enhancing antioxidation in fructose-fed rats［J］.Can J Physiol Pharmacol，2013，91(5):332－7.

［6］Mottillo S，Filion K B，Genest J，et al.The metabolic syndrome and cardiovascular risk a systematic review and meta-analysis［J］.J Am Coll Cardiol，2010，56(14):1113 －32.

［7］Li C B，Li X X，Chen Y G，et al.Huang-lian-jie-du-tang protects rats from cardiac damages induced by metabolic disorder by improving inflammation-mediated insulin resistance ［J］.PLoS One，2013，8(6):e67530.

［8］Alam M A，Kauter K，Brown L.Naringin improves diet-induced cardiovascular dysfunction and obesity in high carbohydrate，high fat diet-fed rats［J］.Nutrients，2013，5(3):637 －50.

［9］Zhang Y，Zhong N，Zhou Z N.Effects of chronic intermittent hypobaric hypoxia on the L-type calcium current in rat ventricular myocytes［J］.High Alt Med Biol，2010，11(1):61 －7.

［10］Guan Y，Gao L，Ma H J，et al.Chronic intermittent hypobaric hypoxia decreases beta-adrenoceptor activity in right ventricular papillary muscle ［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2010，298(4):H1267－72.

［11］Dong J W，Zhu H F，Zhu W Z，et al.Intermittent hypoxia attenuates ischemia/reperfusion induced apoptosis in cardiac myocytes via regulating Bcl-2/Bax expression［J］.Cell Res，2003，13(5):385－91.