三種化學(xué)小分子對(duì)補(bǔ)體旁路激活致內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)的干預(yù)及機(jī)制研究

李朝勝，孫黔云

（1．貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽 550025；2．貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550002）

三種化學(xué)小分子對(duì)補(bǔ)體旁路激活致內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)的干預(yù)及機(jī)制研究

李朝勝1，2，孫黔云2

（1．貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽 550025；2．貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550002）

中國圖書分類號(hào)：R322.12；R329.24；R392.11；R392.12；R977.6

摘要：目的 研究白藜蘆醇（Res）、PDTC和AG490 3種化學(xué)小分子對(duì)補(bǔ)體旁路激活致人微血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)相關(guān)黏附分子表達(dá)的干預(yù)作用和可能的作用機(jī)制。方法 采用補(bǔ)體旁路激活產(chǎn)物作用于人微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HMEC）。TBA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中丙二醛（MDA）的濃度，ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中可溶性黏附分子ICAM-1、VCAM-1、E-selectin的表達(dá)，并采用多個(gè)濃度的Res、NF-κB信號(hào)通路抑制劑PDTC和JAK2信號(hào)通路抑制劑AG490預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞，研究3種抑制劑對(duì)細(xì)胞氧化水平和黏附分子表達(dá)的干預(yù)作用。利用Western blot檢測(cè)補(bǔ)體旁路激活產(chǎn)物作用于內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)NF-κB p65磷酸化的影響及3種抑制劑的干預(yù)作用。結(jié)果 HMEC受補(bǔ)體旁路激活產(chǎn)物刺激后，導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)上清中MDA濃度升高，NF-κB p65磷酸化和黏附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin的表達(dá)上調(diào)。Res可降低細(xì)胞培養(yǎng)上清中MDA的濃度。Res、PDTC和AG490能抑制NF-κB p65的磷酸化。Res與PDTC能抑制內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)，對(duì)E-selectin的表達(dá)有一定的抑制作用，而AG490能夠明顯抑制上述3種黏附分子的表達(dá)。結(jié)論 Res、PDTC和AG490對(duì)補(bǔ)體旁路激活產(chǎn)物致內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)上調(diào)有不同程度的抑制作用，其作用機(jī)制與NF-κB信號(hào)通路的活化有關(guān)，而JAK2可能是一個(gè)更重要的調(diào)控位點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：補(bǔ)體；補(bǔ)體旁路激活；內(nèi)皮細(xì)胞；黏附分子；白藜蘆醇；炎癥反應(yīng)；眼鏡蛇毒因子

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－9－14 14：53 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．038．html

內(nèi)皮細(xì)胞作為血管內(nèi)壁的屏障，與炎癥、心血管疾病、糖尿病、靜脈血栓形成和病毒感染性疾病的發(fā)生發(fā)展直接相關(guān)［1］。其中多種疾病的發(fā)生都伴隨有補(bǔ)體旁路的激活，激活的補(bǔ)體能夠?qū)е聝?nèi)皮細(xì)胞活化，引起一系列結(jié)構(gòu)和功能的改變，在諸如血管擴(kuò)張、血管通透性增加、炎癥細(xì)胞黏附、遷移及趨化等過程中均發(fā)揮重要的作用［2］，并能影響纖溶和凝血功能［3－4］。其中黏附分子的表達(dá)是炎癥反應(yīng)啟動(dòng)和發(fā)展的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。本文研究了Res、PDTC和AG490三種化學(xué)小分子對(duì)補(bǔ)體旁路激活致內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)的干預(yù)作用和可能的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1．1材料 RPMI 1640培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清為天津?yàn)笊锂a(chǎn)品；人ICAM-1、E-selectin、VCAM-1 ELISA檢測(cè)試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；吡咯烷二硫氨基甲酸（pyrro-lidine dithiocarbamate，PDTC）、白藜蘆醇（resveratrol，Res）購自美國Sigma公司；AG490、兔抗人NF-κB p65單克隆抗體（93H1）、MDA檢測(cè)試劑盒為碧云天生物研究所產(chǎn)品；兔抗人β-actin單克隆抗體（13E5）購自美國CST公司；眼鏡蛇毒因子（cobra venom factor，CVF）由本實(shí)驗(yàn)室制備提供，其分離純化和檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)［5］進(jìn)行；正常人血清（normal human serum，NHS）由本實(shí)驗(yàn)室健康志愿者獻(xiàn)血制備，滅活人血清（inactive normal human serum，INHS）由正常人血清56℃滅活30 min制備。

1．2主要儀器 Forma 3111 CO2培養(yǎng)箱和Revco超低溫冰箱（美國Thermo公司）；Nikon TS100倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司）；Spectra MAX-190連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國MD公司）；5810R冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；Elix純水系統(tǒng)和Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；DYCZ-24D型和DYCZ-4013型電泳槽（北京市六一儀器廠）。

1．3實(shí)驗(yàn)方法

1．3．1細(xì)胞培養(yǎng) 人微血管內(nèi)皮細(xì)胞株（HMEC）由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)，用含胎牛血清體積分?jǐn)?shù)為0.2的RPMI 1640培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1．3．2 補(bǔ)體旁路激活產(chǎn)物的制備 參照文獻(xiàn)［6］方法，將CVF（6.5×104U·L－1）與NHS等比例進(jìn)行混合，37℃水浴30 min，CVF激活產(chǎn)物（CVF-activated complement，CAC）根據(jù)需要于臨用時(shí)提前制備。實(shí)驗(yàn)中以CVF與INHS混合制備的孵育物作對(duì)照。

1．3．3CAC對(duì)MDA濃度的影響 HMEC以1× 105cells每孔接種24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后去除細(xì)胞培養(yǎng)液，以溫育的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基清洗1次，加入140 μL無血清RPMI 1640培養(yǎng)基和60 μL CAC孵育產(chǎn)物，分別于不同時(shí)間點(diǎn)取細(xì)胞培養(yǎng)上清，按試劑盒說明書檢測(cè)MDA。

1．3．4CAC對(duì)HMEC黏附分子表達(dá)的影響HMEC以1×104cells每孔接種96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入140 μL溫育的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基和60 μL CAC孵育產(chǎn)物，分別于不同時(shí)間點(diǎn)取細(xì)胞培養(yǎng)上清，按試劑盒說明書檢測(cè)E-selectin、ICAM-1和VCAM-1。

1．3．5Western blot檢測(cè)CAC對(duì)NF-κB p65磷酸化的作用 HMEC以5×105cells接種75 mL培養(yǎng)瓶，48 h后棄去培養(yǎng)基，加入CAC并以無血清RPMI 1640培養(yǎng)基補(bǔ)足至2 mL，于37℃培養(yǎng)箱中分別作用5 min、30 min和1 h。棄上清，在冰水浴中刮取細(xì)胞，提取細(xì)胞質(zhì)蛋白，經(jīng)BCA蛋白定量后以SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，經(jīng)一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h后，以DAB顯色試劑顯色后晾干拍照。照片以Image J作圖軟件進(jìn)行灰度分析。

1．3．6Res對(duì)MDA的干預(yù)作用 HMEC以1×105cells每孔接種24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后去除細(xì)胞培養(yǎng)液，以溫育的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基清洗1次，加入140 μL以無血清RPMI 1640培養(yǎng)基配制的Res，37℃預(yù)處理1 h后加入60 μl CAC，輕輕混勻后培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液按試劑盒說明書檢測(cè)MDA。

1．3．7Res、PDTC和AG490對(duì)黏附分子表達(dá)的干預(yù)作用 HMEC以1×104cells每孔接種96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后去除細(xì)胞培養(yǎng)液，以溫育的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基清洗1次，加入140 μL以無血清RPMI 1640培養(yǎng)基配制的Res、PDTC、AG490，37℃預(yù)處理1 h后加入60 μL CAC，輕輕混勻后分別作用不同時(shí)間，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，按試劑盒說明書檢測(cè)E-selectin、ICAM-1和VCAM-1。

1．3．8Res、PDTC和AG490對(duì)NF-κB p65磷酸化的干預(yù)作用 HMEC以5×105cells接種75 mL培養(yǎng)瓶，48 h后棄去培養(yǎng)基，以溫育的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基清洗1次，加入1 400 μL以無血清RP-MI 1640培養(yǎng)基配制的的Res（20 μmol·L－1）、PDTC（100 μmol·L－1）和AG490（100 μmol·L－1），37℃預(yù)處理1 h后，加入600 μL CAC，輕輕混勻后37℃作用30 min，于冰水浴中刮取細(xì)胞提取胞質(zhì)蛋白，按前述方法進(jìn)行Western blot檢測(cè)和灰度分析。1．3．9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)以±s表示，以SPSS 19．0進(jìn)行單因素方差分析。

2　結(jié)果

2．1CAC對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞MDA濃度的影響及Res的作用 CAC作用于內(nèi)皮細(xì)胞，其細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA濃度隨作用時(shí)間延長(zhǎng)含量逐漸升高，在12 h時(shí)檢測(cè)到MDA濃度的升高（P＜0.05），24 h時(shí)差異更明顯（P＜0.01）。5 μmol·L－1的Res即可明顯降低MDA的濃度，與模型組相比差異具有顯著性（P＜0.01）（Fig 1）。

Fig 1 Effect of CAC on MDA concentration（n＝4）

2．2CAC對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)的影響

2．2．1Res、PDTC和AG490對(duì)ICAM-1表達(dá)的作用CAC作用于內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致ICAM-1的表達(dá)上調(diào)，在6 h時(shí)檢測(cè)到表達(dá)的高峰，與之前的結(jié)果類似［6］。不同濃度的Res、PDTC和AG490都能抑制ICAM-1的表達(dá)，其中10和20 μmol·L－1的Res、50和100 μmol·L－1的PDTC和20、50、100 μmol·L－1的AG490與模型組相比差異有顯著性（P＜0.01或P ＜0.05）（Fig 2）。

2．2．2Res、PDTC和AG490對(duì)VCAM-1表達(dá)的作用CAC作用于內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致VCAM-1的表達(dá)上調(diào)，在6 h時(shí)檢測(cè)到表達(dá)的高峰（數(shù)據(jù)未列）。測(cè)試的不同濃度的Res PDTC和AG490都能明顯抑制VCAM-1的表達(dá)（P＜0.01）（Fig 3）。

2．2．3Res、PDTC和AG490對(duì)E-selectin表達(dá)的作用 CAC作用于內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致E-selectin的表達(dá)上調(diào)，并在12 h時(shí)檢測(cè)到表達(dá)的高峰，與之前的結(jié)果類似［6］。Res和PDTC能在一定程度上抑制E-se-lectin的表達(dá)，而AG490能明顯抑制E-selectin的表達(dá)（P＜0.01）（Fig 4）。

Fig 2 Effect of Res，PDTC and AG490 on ICAM-1 expression induced by CAC for 6 h（n＝4）

Fig 3 Effect of Res，PDTC and AG490 on VCAM-1 expression induced by CAC for 6 h（n＝4）

Fig 4 Effect of Res，PDTC and AG490 on E-selectin expression induced by CAC for 12 h（n＝4）

2．3補(bǔ)體旁路激活對(duì)NF-κB p65磷酸化的作用CAC分別刺激HMEC 5、30和60 min，檢測(cè)到30 min組的NF-κB p65的磷酸化作用最明顯（Fig 5）。Res、PDTC和AG490對(duì)補(bǔ)體旁路激活產(chǎn)物引起的NF-κB p65磷酸化都表現(xiàn)出一定的抑制作用（Fig 6）。

Fig 5 NF-κB p65 phosphorylation in HMECS after

Fig 6 Effect of different inhibitors on inhibiting NF-κB p65 phosphorylation in HMECS after exposure to CAC for 30 min（n＝3）

3　討論

補(bǔ)體旁路激活在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，補(bǔ)體激活產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和功能改變，引起多種細(xì)胞因子的表達(dá)變化。本研究在課題組前期工作的基礎(chǔ)上，采用CVF這一高度特異的補(bǔ)體替代途徑激活蛋白來激活補(bǔ)體旁路。CVF在血清環(huán)境中可與補(bǔ)體B因子特異性結(jié)合，形成CVF·B復(fù)合物，它能被補(bǔ)體D因子特異性地識(shí)別和酶切，進(jìn)而形成CVF·Bb復(fù)合物。該復(fù)合物具有C3／C5轉(zhuǎn)化酶的活性，可以持續(xù)激活補(bǔ)體旁路途徑，產(chǎn)生C3a、C3b、C5a及攻膜復(fù)合物等一系列活化產(chǎn)物。這種補(bǔ)體旁路途徑的激活方式與體內(nèi)病理生理?xiàng)l件下補(bǔ)體旁路途徑的過度激活高度一致［6］。

研究結(jié)果顯示，內(nèi)皮細(xì)胞受到CAC刺激后會(huì)引起MDA濃度的持續(xù)升高，5 μmol·L－1的Res即能明顯抑制補(bǔ)體旁路激活產(chǎn)物引起的MDA水平增高。這表明，補(bǔ)體旁路激活產(chǎn)物刺激內(nèi)皮細(xì)胞存在氧化應(yīng)激的作用，而Res能有效抑制氧化應(yīng)激，與文獻(xiàn)［7］報(bào)道的Res的抗氧化作用相吻合。

之前的研究表明，補(bǔ)體旁路激活會(huì)引起內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB、JAK2和p38 MAPK信號(hào)通路的活化［8］，導(dǎo)致黏附分子P-selectin、ICAM-1和E-selectin的表達(dá)上調(diào)［6］。本實(shí)驗(yàn)采用能夠抑制NF-κB信號(hào)通路和氧化應(yīng)激的Res、NF-κB信號(hào)通路特異性抑制劑PDTC和JAK2信號(hào)通路特異性抑制劑AG490對(duì)黏附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin的表達(dá)進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果顯示，補(bǔ)體旁路激活產(chǎn)物刺激內(nèi)皮細(xì)胞，引起NF-κB p65的磷酸化和內(nèi)皮細(xì)胞可溶性黏附分子ICAM-1、VCAM-1、E-selectin的蛋白表達(dá)上調(diào)。Res、PDTC和AG490都能抑制NF-κB p65的磷酸化，但對(duì)黏附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin表達(dá)的作用結(jié)果不同。Res與PDTC的作用結(jié)果相似，都能抑制ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)，但對(duì)E-se-lectin表達(dá)的抑制作用不明顯。這提示，NF-κB信號(hào)通路是補(bǔ)體旁路激活致黏附分子ICAM-1和VCAM-1表達(dá)的重要調(diào)控路徑，但E-selectin的表達(dá)與NF-κB的關(guān)聯(lián)度不高。AG490能明顯抑制上述三種黏附分子的表達(dá)上調(diào)，提示了JAK2在補(bǔ)體旁路激活致黏附分子表達(dá)中可能是一個(gè)更重要的干預(yù)靶點(diǎn)。

目前的研究表明，與炎癥相關(guān)的NF-κB、JAK2 和MAPK信號(hào)通路之間存在網(wǎng)絡(luò)交互性，同時(shí)氧化應(yīng)激在炎癥相關(guān)黏附分子的表達(dá)中也扮演著重要角色，其中VCAM-1的表達(dá)與NADPH氧化酶的活化和ROS的增高密切相關(guān)［9－11］。之前的研究表明，補(bǔ)體旁路激活引起的黏附分子表達(dá)變化至少涉及NF-κB和JAK2通路的活化，PDTC和AG490合用時(shí)能

更明顯抑制ICAM-1的表達(dá)［8］。目前對(duì)Res的研究表明，Res能抑制NF-κB信號(hào)通路的活化和氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激主要與NADPH氧化酶活性相關(guān)，對(duì)NADPH氧化酶活性的抑制能減少ROS的生成［7］，同時(shí)ROS又能刺激NF-κB的活化，這兩種作用在Res抑制補(bǔ)體旁路激活致內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)過程中是否同步存在尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。而Western blot的檢測(cè)結(jié)果提示，AG490對(duì)JAK2的抑制也導(dǎo)致了對(duì)NF-κB p65磷酸化的抑制，JAK2可能是補(bǔ)體旁路激活致內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中NF-κB和JAK2所組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一個(gè)上游調(diào)控位點(diǎn)。

本研究表明，Res、PDTC和AG490三種化學(xué)小分子對(duì)補(bǔ)體旁路激活致內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)上調(diào)有不同程度的抑制作用，其作用機(jī)制與NF-κB信號(hào)通路的活化有關(guān)，而JAK2可能是一個(gè)更重要的調(diào)控位點(diǎn)。本研究為進(jìn)一步闡明補(bǔ)體旁路激活致內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制和潛在的作用靶點(diǎn)提供線索，同時(shí)也為Res的開發(fā)應(yīng)用提供參考依據(jù)。

（致謝：本文實(shí)驗(yàn)是在貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藥理與活性篩選中心孫黔云研究員課題組的實(shí)驗(yàn)室完成。）

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Effect of three chemical molecules on adhesion molecules expression in HMECs induced by activated complement alternative pathway

LI Chao-sheng1，2，SUN Qian-yun2
（1．Dept of Pharmacology，Guizhou University，Guiyang 550025，China；2．The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products，Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences，Guiyang 550002，China）

Abstract：Aim To investigate the effect of resveratrol （Res），PDTC and AG490 on adhesion molecules ex-pression induced by product of activated complement alternative pathway on human microvascular endothelial cells（HMECs）and the possible mechanisms．Meth- ods HMECs were exposed to the product of comple-ment alternative pathway activation，then the superna-tant was removed to detect the concentration of malond-ialdehyde（MDA）with TBA method．ELISA method was used to detect the expression of soluble ICAM-1，

VCAM-1（and E-selectin）in the culture supernatant．Res，PDTC and AG490 with different concentrations were used to determine their effect on cell oxidation level and adhesion molecules expression．The phospho-rylation of NF-κB p65 was detected by Western blot，and the intervention of Res，PDTC and AG490 was as-sayed by the same way．Results The activation of complements alternative pathway resulted in the phos-phorylation of NF-κB p65，and increased the concen-tration of MDA and up-regulated the expression of ICAM-1，VCAM-1 and E-selectin．Res reduced the concentration of MDA．Res，PDTC and AG490 inhibi-ted the phosphorylation of NF-κB p65．Res and PDTC showed similar inhibition on expression of ICAM-1 and VCAM-1，while exhibiting little effect on expression of E-selectin，and AG490 significantly inhibited the ex-pression of the above adhesion molecules．Conclusions Res，PDTC and AG490 could inhibit the expression of adhesion molecules induced by activated complement alternative pathway，the inhibition of NF-κB pathway activation was involved in their mechanism，and JAK2 may be a more important intervention target in regula-ting adhesion molecule expression．

Key words：complement；complement alternative path-way（activation）；endothelial cell；adhesion molecule；resveratrol；inflammation；cobra venom factor

作者簡(jiǎn)介：李朝勝（1988－），男，碩士生，研究方向：天然藥物成分及生理活性，E-mail：lics＿1988＠163．com；孫黔云（1968－），男，博士，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：生化藥理與新藥發(fā)現(xiàn)，通訊作者，Tel：0851-83805095，F(xiàn)ax：0851-83805081，E-mail：sunqy＠hotmail．com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 31060124）；貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長(zhǎng)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目［黔省專合字（2012）9號(hào)］

收稿日期：2015－06－08，修回日期：2015－07－06

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）10－1421－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．019