吳茱萸堿調控人結腸癌HCT-116細胞中JAK2／STAT3信號通路的機制研究

趙綠翠，廖 科，李科瓊，李 靜

（重慶醫科大學1．干細胞與組織工程研究室、2．藥物高校工程研究中心，重慶 400016；3．成都市腫瘤醫院，四川成都 610041）

吳茱萸堿調控人結腸癌HCT-116細胞中JAK2／STAT3信號通路的機制研究

趙綠翠1，2，廖 科3，李科瓊1，李 靜1

（重慶醫科大學1．干細胞與組織工程研究室、2．藥物高校工程研究中心，重慶 400016；3．成都市腫瘤醫院，四川成都 610041）

中國圖書分類號：R329．25；R735.350.22；R979.1

摘要：目的 探討吳茱萸堿（evodiamine，EVO）對人結腸癌HCT-116細胞中JAK2／STAT3信號通路的影響。方法

EVO誘導人結腸癌HCT-116細胞2、4、6 h后，Hoechst法檢測細胞核凋亡的形態學改變；6 μmol·L－1的EVO作用于HCT-116細胞2、4和6 h，不同濃度的AG490作用于HCT-116細胞48 h，6 μmol·L－1的EVO和50 μmol·L－1的AG490分別誘導HCT-116細胞以及兩藥聯合誘導HCT-116細胞6 h后，運用蛋白質印跡法檢測各組細胞中JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3的蛋白表達量。結果 鏡下觀察EVO誘導后的細胞核濃縮聚集，染色質邊緣化，并出現染色質碎裂成塊，形成凋亡小體等形態學改變。Western blot結果顯示：EVO可以明顯下調HCT-116細胞內p-STAT3的表達；AG490可以抑制JAK2／STAT3信號通路的激活；EVO對JAK2／STAT3信號通路中p-STAT3蛋白的表達抑制效果較AG490更明顯，且兩藥聯合應用后抑制效果進一步增強。結論 EVO對人結腸癌HCT-116細胞的抗腫瘤活性有可能是通過抑制JAK2／STAT3信號通路的激活來發揮的。

關鍵詞：吳茱萸堿；HCT-116細胞；JAK2／STAT3信號通路；p-STAT3；AG490；抗腫瘤活性

網絡出版時間：2015－9－14 14：53 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．028．html

近年來結腸癌的致死率在全球所有癌癥致死率中排名第4位，每年因結腸癌的死亡人數約為69.4萬［1］。結腸癌目前的治療除手術治療外，主要采用化療和放療的聯合治療方式，由于化療藥物的毒副作用較大，因此用中藥治療結腸癌，提高患者的生活質量成為目前國內研究的熱點。有研究表明，吳茱萸堿對多種腫瘤細胞，如人乳腺癌MDA-MB-231細胞［2］、人肝癌HepG2細胞［3］、鼠黑色素瘤B16-F10細胞［4］等具有明顯的腫瘤抑制作用，但其對人結腸癌HCT-116細胞的抗腫瘤活性鮮有報道。STAT3在腫瘤細胞中呈高表達，JAK2／STAT3信號通路的過度活化與多種腫瘤的惡性轉化有密切關系。吳茱萸堿對人結腸癌細胞HCT-116中JAK2／STAT3信號通路的藥理作用尚不清楚。本研究觀察了吳茱萸堿對人結腸癌HCT-116細胞的殺傷作用，并探討其抗腫瘤活性的可能機制。

1　材料與方法

1．1主要試劑與儀器 吳茱萸堿（evodiamine，EVO）標準品購自中國南京澤朗醫藥公司（批號：ZL20131015，HPLC檢測純度大于0．98）；AG490購自美國Tocris生物科學公司；IL-6購自美國Sigma公司；BCA蛋白定量檢測試劑盒和Hoechst染色試劑盒均購自碧云天生物技術研究所；兔抗人JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3抗體、β-actin抗體和辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG均購于美國Cell Sig-naling Technology公司。M450酶標測定儀，垂直電泳儀，電轉儀，化學發光成像系統購自美國Bio-Rad公司；CO2恒溫細胞培養箱購自美國Forma scientific公司；高速臺式離心機購自美國Sigma公司。

1．2細胞培養和藥物誘導 HCT-116結腸癌細胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基于CO2恒溫細胞培養孵箱常規培養，待細胞處于對數生長期時，將貼壁細胞消化并離心5 min，離心轉速為1 000 r·min－1，隨后將細胞團重懸制成單細胞懸液，以5 ×108·L－1的密度接種于10 cm的培養皿中，置于培養箱。當細胞生長融合度至60%～70%，用不含血清的培養基處理24 h后，加入藥物誘導。常規細胞培養組為對照組；合適濃度的EVO或AG490誘導HCT-116細胞組作為藥物誘導組。

1．3Hoechst法檢測細胞核的變化 取處于生長對數期的人結腸癌HCT-116細胞，以2×108·L－1的密度接種于無菌蓋玻片上，并置于6孔板中，待細

胞貼壁后加入6 μmol·L－1的EVO，分別誘導2，4，6 h作為藥物誘導組，并設置不加藥的細胞組為對照組，每組平行接種3個復孔。棄掉舊培養液，每孔加入1 mL的4%多聚甲醛，固定30 min。去除固定液，用PBS洗滌2遍，每次3 min。吸盡液體，加入1 mL的Hoechst 33258染色液，染色8 min。吸去液體，稍微晾干。用PBS洗2遍，每次3 min，洗滌時手輕輕晃動6孔板。于避光的條件下，滴1～2滴50%甘油于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，盡量避免有氣泡產生。于熒光顯微鏡下觀察，激發波長為350 nm左右，發射波長460 nm左右。

1．4Western blot法檢測細胞中JAK2、p-JAK2，STAT3和p-STAT3等蛋白表達量的變化

1．4．1EVO對細胞中目的蛋白表達量的影響 取長勢良好的HCT-116細胞，以5×108·L－1的密度接種于10 cm的培養皿中。待細胞處于對數生長期時，根據我們前期研究所篩選出的藥物濃度［5］，將實驗組別設置為：對照組、實驗組（6 μmol·L－1的EVO分別誘導HCT-116細胞2、4和6 h）。收集各組細胞，用細胞裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定各組蛋白含量并配平，使各組蛋白終濃度一致。每個點樣孔加40 μg蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白。根據目的蛋白分子大?。篔AK2（130 ku）、p-JAK2（125 ku）、STAT3（86 ku）和p-STAT3 （92 ku）剪切適當大小的凝膠。將凝膠上的蛋白轉至PVDF膜，用5%的BSA封閉膜上的蛋白結合位點2 h。采用兔抗人JAK2（1∶1 000）、p-JAK2（1∶1 000）、STAT3（1∶1 000）、p-STAT3（1∶1 000）；兔抗人內參β-Actin（1∶1 000），4℃孵育過夜。用TBST溶液漂洗3次，每次10 min。分別加入辣根過氧化物標記的山羊抗兔IgG（1∶1 000）常溫孵育1.5 h。用TBST溶液漂洗后用顯色劑ECL顯色、曝光。運用圖像分析軟件Quantity One測定條帶的灰度值，用對照組及其余各組目的條帶灰度值分別和內參條帶的灰度值的比值表示蛋白表達水平，統計分析后作圖。

1．4．2AG490對細胞中目的蛋白表達量的影響實驗設置組別為：對照組、實驗組（0.5、5和50 μmol ·L－1AG490組）。AG490作用48 h后，用25 μg· L－1的IL-6處理15 min并收集各組細胞，Western blot法檢測各組細胞中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3等蛋白表達量的變化。

1．4．3EVO和AG490對細胞中目的蛋白表達抑制率的比較 實驗設置5個組別：陰性對照組、對照組、50 μmol·L－1AG490＋IL-6誘導組、6.0 μmol· L－1EVO＋IL-6誘導組和（50 μmol·L－1AG490＋6.0 μmol·L－1EVO）＋IL-6誘導組。在收集細胞之前除陰性對照組外，其余各組均用25 μg·L－1的IL-6處理15 min。Western blot法檢測各組細胞中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3等蛋白表達量的變化。

1．5統計學分析 采用SPSS 16．0統計軟件對所得數據進行分析，計量資料以±s表示。兩樣本均數間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

2　結果

2．1EVO誘導HCT-116細胞的凋亡 如Fig 1所示，6.0 μmol·L－1的EVO分別作用于HCT-116細胞2、4、6 h后，可見細胞核的染色質濃縮聚集，邊緣化，并出現染色質碎裂成塊，形成凋亡小體，且這種變化呈時間依賴性。這表明，EVO對人結腸癌HCT-116細胞有誘導凋亡的作用。

Fig 1 Effect of EVO on morphology of HCT-116 cell nucleus by fluorescence microscopy

2．2EVO對HCT-116細胞中目的蛋白的影響如Fig 2（A，B）所示，Western blot檢測結果顯示，6.0 μmol·L－1的EVO分別作用于HCT-116細胞2、4、6 h后，p-STAT3蛋白的表達量呈下降的趨勢，與對照組之間的對比差異有顯著性（P＜0.05）。這一結果表明，吳茱萸堿對HCT-116細胞的體外抗腫瘤活性，可能是通過抑制JAK2／STAT3信號通路的激活而發揮作用。

2．3AG490對HCT-116細胞中目的蛋白的影響如Fig 3（A，B）所示，Western blot檢測結果顯示，

不同濃度JAK2的特異性抑制劑AG490（0.5、5、50 μmol·L－1）分別作用于HCT-116細胞48 h后，與對照組比較，JAK2、P-STAT3等目的蛋白的表達量均表現出下降的趨勢，與對照組比較差異均有顯著性（P＜0.05），結果提示：50 μmol·L－1的AG490可以明顯阻滯JAK2／STAT3信號通路的激活，因此后續試驗中選用50 μmol·L－1的AG490作為誘導HCT-116細胞的最佳藥物濃度。

Fig 2 Cells treated with 6 μmol·L－1EVO for various lengths of time，and then analyzed for the level changes of JAK2，p-JAK2，STAT3 and p-STA3 by Western blot

2．4EVO和AG490對HCT-116細胞中目的蛋白抑制作用的比較 如Fig 4（A，B），Western blot檢測結果顯示，陰性對照組和加入IL-6組比較，IL-6僅對目的蛋白中p-STAT3的活化作用差異有統計學意義，因此可以排除IL-6的加入對AG490和EVO分別對HCT-116細胞中各目的蛋白作用的干擾。用濃度為6.0 μmol·L－1的EVO和50 μmol·L－1的AG490誘導HCT-116細胞6 h后，與對照組比較，EVO誘導組較AG490誘導組對p-STAT3蛋白的下調作用更明顯；且兩藥聯合誘導后，表現出協同作用，對HCT-116細胞中p-STAT3的表達抑制作用較單獨用藥更明顯。

Fig 3 HCT-116 cells induced by AG490 and then stimulated with 25 μg·L－1IL-6 for 15 min

3　討論

STAT3在腫瘤細胞中呈高表達，被認為是癌基因，且STAT3的活化及過度表達與細胞的惡化有關［6－8］。JAK2／STAT3信號通路的過度活化與乳腺癌、結腸癌、神經膠質瘤和皮膚癌等［9－10］多種腫瘤的發生和進展密切相關。在JAK／STAT信號激活的過程中，IL-6首先與IL-6受體（IL-6Rα）結合，繼而激活胞質內JAK，然后STAT在JAK的催化下發生磷酸化，程序性激活JAK2／STAT3信號通路，從而參與調控腫瘤的侵襲和遷移［11－12］。因此，本研究中用IL-6激活JAK2／STAT3信號通路進行實驗。我們發現，有研究表明［13］，STAT3的早期磷酸化發生在藥物誘導6 h。因此，我們分別采取EVO處理HCT-116細胞2、4、6 h作為實驗所用的時間梯度。結果表明，EVO可以明顯減少HCT-116細胞中p-STAT3的表達。

AG490作為JAK2／STAT3信號通路的特異性抑制劑可以阻斷該信號通路的激活。Western blot結

果顯示：經AG490處理后，HCT-116細胞中JAK2／STAT3信號通路的激活被阻斷。另與AG490誘導組相比，EVO誘導組對HCT-116細胞中的p-STAT3的表達抑制作用更為明顯，并呈時間依懶性；與AG490誘導組和EVO單獨誘導組相比，EVO和AG490聯合誘導組可進一步抑制HCT-116細胞中JAK2／STAT3信號通路中p-STAT3蛋白的表達。

Fig 4 HCT-116 cells treated with 50 μmol·L－1AG490，6 μmol· L－1EVO or 50 μmol·L－1AG490 combined with 6 μmol·L－1EVO for 2，4，6 h and then stimulated with 25 μg·L－1IL-6 for 15 min

綜上所述，較低濃度的吳茱萸堿短時間內即可誘導人結腸癌HCT-116細胞的凋亡。吳茱萸堿對人結腸癌HCT-116細胞有明顯的抗腫瘤活性，其作用機制可能與吳茱萸堿明顯抑制HCT-116細胞中JAK2／STAT3信號通路的激活有關，因而吳茱萸堿可以作為一種潛在的STAT3磷酸化的有效抑制劑，同時為開發一種低毒高效的抗腫瘤藥物或藥物前體提供了一定的參考價值。

（致謝：本實驗在重慶醫科大學干細胞與組織胚胎研究工程室完成。衷心感謝組胚平臺的所有老師及同學對我的支持與幫助！尤其感謝李靜老師在課題經費方面對該研究作出的支持與貢獻；感謝廖科同學給予我實驗技術方面的指導；感謝李科瓊在實驗數據統計分析方面給予我很大的幫助，正是有了你們的幫助才使我順利完成該研究。）

參考文獻：

［1］ Nasri H，Rafieian-kopaei M．World cancer report 2014［J］．Cell J，2014，16（3）：383－4．

［2］ Du J，Wang X F，Zhou Q M，et al．Evodiamine induces apoptosis and inhibits metastasis in MDAMB-231 human breast cancer cells in vitro and in vivo［J］．Oncol Reports，2013，30（2）：685－94．

［3］ 朱麗紅，劉小東，譚宇蕙，等．吳茱萸堿對人肝癌細胞HepG2的生長抑制及誘導凋亡作用［J］．中國藥理學通報，2009，25 （1）：68－71．

［3］ Zhu L H，Liu X D，Tan Y H，et al．Proliferation－inhibited and apoptosis inducted effects of evodiamine on human hepatoma cell line HepG2［J］．Chin Pharmacol Bull，2009，25（1）：68－71．

［4］ Menon L G，Kuttan R，Kuttan G．Anti-metastatic activity of cur-cumin and catechin［J］．Cancer Lett，1999，141（1－2）：159－65．

［5］ 趙綠翠，張景?，李 靜，等．吳茱萸堿對人結腸癌細胞周期阻滯及凋亡的影響［J］．中國藥理學與毒理學雜志，2014，28 （6）：863－9．

［5］ Zhao L C，Zhang J Q，Li J，et al．The mechanism of apoptosis and cell cycle arrest in human colorectal cancer cells induced by Evodiamine［J］．Chin J Pharmacol Toxicol，2014，28（6）：863 －9．

［6］ Turkson J，Jove R．STAT proteins：novel molecular targets for cancer drug discovery［J］．Oncogene，2000，19（56）：6613－26．

［7］ Turkson J，Bowman T，Garcia R，et al．Stat3 activation by Src in-duces specific gene regulation and is required for cell transforma-tion［J］．Mol Cell Biol，1998，18（5）：2545－52．

［8］ Devarajan E，Huang S．STAT3 as a central regulator of tumor me-tastases［J］．Current Mol Med，2009，9（5）：626－33．

［9］ Kusaba T，Nakayama T，Yamazumi K，et al．Expression of p-STAT3 in human colorectal adenocarcinoma and adenoma；correla-tion with clinicopathological factors［J］．J Clin Pathol，2005，58 （8）：833－8．

［10］Shih Y P，Liao Y C，Lin Y，Lo S H．DLC1 negatively regulates angiogenesis in a paracrine fashion［J］．Cancer Res，2010，70 （21）：8270－5．

［11］Gurbuz V，Konac E，Varol N，et al．Effects of AG490 and S3I-201 on regulation of the JAK／STAT3 signaling pathway in relation to angiogenesis in TRAIL-resistant prostate cancer cells［J］．On-col Lett，2014，7（3）：755－63．

［12］Germain D，Frank D A．Targeting the cytoplasmic and nuclear functions of signal transducers and activators of transcription 3 for cancer therapy［J］．Clin Cancer Res，2007，13（19）：5665－9．

［13］Shih W L，Yu F L，Chang C D，et al．Suppression of AMF／PGI-mediated tumorigenic activities by ursolic acid in cultured hepato-ma cells and in a mouse model［J］．Mol Carcinogen，2013，52 （10）：800－12．

Modulatory effect of Evodiamine on JAK2／STAT3 signal pathway in HCT-116 cells

ZHAO Lyu-cui1，LIAO Ke2，LI Ke-qiong3，LI Jing3
（1．Dept of Stem Cell and Tissue Engineering，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2．Drug Engineering Research Center of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；3．Chengdu Tumor Hospital，Chengdu 610041，China）

Abstract：Aim To investigate the inhibitory effect of Evodiamine on JAK2／STAT3 signal pathway in human colorectal cancer cell line HCT-116．Methods Cells were cultured with 6．0 μmol·L－1Evodiamine for 2，4 and 6 h，respectively．Cell nuclear morphology was detected by Hoechst staining and protein expression levels of JAK2，p-JAK2，STAT3 and p-STAT3 were examined by Western blot．Cells were treated with dif-ferent concentrations of AG490 for 48 h to select proper working concentration and cells treated with 6 μmol· L－1EVO and 50 μmol·L－1AG490 to compare the modulatory effect of EVO with AG490 on JAK2／STAT3 signal pathway．Results Hoechst staining revealed that Evodiamine could induce cells apoptosis，chroma- tin condensation gathered and typical apoptotic mor-phological changes in a time-dependent manner；West-ern Blot suggested that EVO could inhibit p-STAT3 significantly．After treatment with AG490，JAK2／STAT3 signal pathway was inactivated，the inhibitory effect of EVO on p-STAT3 was stronger than that of AG490，while EVO combined with AG490 could fur-ther inhibit the expression of p-STAT3 significantly．Conclusions The anticancer effect of Evodiamine is mainly mediated by the modulation of JAK2／STAT3 signal pathway in HCT-116 cells．

Key words：Evodiamine（EVO）；HCT-116 cells；JAK2／STAT3 signal pathway；p-STAT3；AG490；an-ticancer effect

作者簡介：趙綠翠（1986－），女，碩士生，研究方向：藥物的抗腫瘤活性及其藥理學作用機制，E-mail：lvcuizhao＠sina．com；李 靜（1973－），女，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：藥物抗腫瘤，通訊作者，Tel：023-68485614，E-mail：li-jingyangyang＠126．com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 31271368）；重慶市渝中區科技計劃項目（No 20140123）

收稿日期：2015－06－04，修回日期：2015－07－27

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）10－1394－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．014