六味地黃湯輔助環(huán)磷酰胺對荷H22肝癌小鼠MMP9、NF-KB表達的影響*

★　饒斌　謝斌　謝雄　余功　劉紅寧　(江西中醫(yī)藥大學　南昌 330004)

*基金項目：國家自然科學基金項目(81260523)；江西省研究生創(chuàng)新基金項目(YC2014-S275)；江西中醫(yī)藥大學研究生創(chuàng)新基金項目(JZYC14A02)。

六味地黃湯輔助環(huán)磷酰胺對荷H22肝癌小鼠MMP9、NF-KB表達的影響*

★饒斌*第一作者：饒斌，碩士研究生。研究方向：中醫(yī)藥抗腫瘤。E-mail:837585272@qq.com。謝斌謝雄余功劉紅寧*通信作者：劉紅寧，教授，博士生導師。研究方向：中醫(yī)基礎(chǔ)理論。E-mail:lhongnin@yahoo.com.cn。(江西中醫(yī)藥大學南昌 330004)

*基金項目：國家自然科學基金項目(81260523)；江西省研究生創(chuàng)新基金項目(YC2014-S275)；江西中醫(yī)藥大學研究生創(chuàng)新基金項目(JZYC14A02)。

摘要：目的：觀察六味地黃湯輔助環(huán)磷酰胺對荷H22肝癌小鼠MMP9、NF-KB表達的影響。方法：雄性昆明小鼠40只，隨機分為模型組、化療組、六味組、六味化療組，每組10只。腋下注射H22細胞建立H22荷瘤模型，六味組造模前兩周開始用藥(劑量為22g/kg·d)，化療組(劑量為50mg/kg·d,隔日1次)及六味化療組造模后用藥，造模14d后處死小鼠稱重，取瘤組織稱重計算抑瘤率，取脾組織稱重計算脾指數(shù)，免疫組化檢測MMP9、NF-kB蛋白的表達。結(jié)果：化療組及六味化療聯(lián)合組具有明顯的抑瘤作用，與模型組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，與六味組比較，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；六味組脾指數(shù)增大，與模型組及化療組比較，均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，六味化療聯(lián)合組的脾指數(shù)均高于化療組，有顯著性差異(P<0.01)；與模型組比較六味化療聯(lián)合組MMP9蛋白表達水平顯著下降(P<0.05)，六味、化療、六味化療聯(lián)合均可顯著降低NF-kB蛋白的表達水平，與模型組比較，有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論：六味地黃湯輔助環(huán)磷酰胺可提高動物免疫功能，其抗肝癌的協(xié)同機制可能不是通過NF-KB，而是通過降低肝癌組織MMP9蛋白表達來實現(xiàn)。

關(guān)鍵詞：六味地黃湯；環(huán)磷酰胺；肝癌；MMP9；NF-KB

肝癌是常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居高不降，如何提高肝癌的臨床治療效果是當今醫(yī)學領(lǐng)域迫切需要解決的重大課題之一。六味地黃湯是中醫(yī)滋陰經(jīng)典方劑，其可通過增強免疫、增強抑癌基因表達、改善細胞間的物質(zhì)信息通訊、防止致癌物所致突變和癌變、對增殖及轉(zhuǎn)移影響、對血管生成的影響等方面而發(fā)揮預防、治療及輔助治療腫瘤的療效[1]。然而在現(xiàn)有的報道中其之于肝癌的治療多處于輔助增效的地位[2-3]，因此將六味地黃湯引用到與化療藥物聯(lián)用治療肝癌中，并探討其聯(lián)用機理對于該方在肝癌臨床上的推廣使用具有一定的意義。環(huán)磷酰胺是廣譜抗腫瘤藥，臨床上廣泛用于肝癌及其他各種腫瘤的治療。故本研究擬觀察六味地黃湯聯(lián)合環(huán)磷酰胺對荷H22肝癌小鼠MMP9、NF-KB表達的影響，探討該方輔助化療藥物抗肝癌的治療機制。

1材料和方法

1.1動物及瘤株動物：SPF級雄性KM小鼠,體重20±2g,江西中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(贛)2011-0001。

瘤株：小鼠H22肝癌細胞來源：中國醫(yī)學科學院腫瘤細胞庫提供。

1.2藥物及制備六味地黃湯：熟地15g，山茱萸12g，山藥12g，丹皮10g，澤瀉10g，茯苓10g(購自江西省中醫(yī)院中藥房)。將以上中藥加10倍量的清水浸泡1h,然后煎煮，水沸后以小火煎40min，過濾；第二次加8倍量的清水煎熬，水沸后小火煎40min，過濾，合并濾液，常壓濃縮至69mL(即每1 mL藥液含1g原藥)，冷卻后密封，4℃保存?zhèn)溆谩嶒炈幬餄舛葹?2g/(kg·d)。陽性藥物為注射用環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX，批號13111325)0.2g/瓶，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供。CTX藥物濃度為50mg/(kg·d),隔日1次。

1.3試劑及儀器抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒(Dako Denmark A/S，批號20140425)；NF-KBp65一抗(proteintech，批號00017138)；MMP9一抗(proteintech，批號00020746)；二抗HRP標記山羊抗兔(谷歌生物，批號20140415)；BSA(Roche，批號3200687)；倒置顯微鏡(LEICA,DMI3000B)；切片機(上海徠卡儀器有限公司，RM2016)；烘箱(上海福瑪實驗設(shè)備有限公司，DGX-9003B)；脫色搖床(北京六一儀器廠，WD-9405A)；普通光學顯微鏡(重慶光電儀器有限公司，XSP-C204)。

1.4動物處理

1.4.1肝癌H22細胞接種方法小鼠肝癌H22細胞的培養(yǎng)及傳代:將腹水型小鼠肝癌H22細胞,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱,用含10% FCS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)。取最佳生長狀態(tài)的小鼠肝癌H22細胞,濃度調(diào)為5×106個/mL,以0.2 mL/只(1×106個細胞/只)無菌注入小鼠腹腔進行接種傳代,于接種7～9d,小鼠腹部膨隆,出現(xiàn)腹水,可用于小鼠皮下移植瘤的接種。

1.4.2動物模型制作荷H22肝癌小鼠模型的建立[4]：將接種H22瘤種7～9d，腹部隆起明顯的腹水瘤小鼠以脫頸法處死，無菌條件下從腹腔抽出瘤液，以無菌生理鹽水稀釋后,1500 r/min離心5 min,調(diào)整瘤細胞濃度為5×106個/mL,于小鼠右腋下行皮下無菌接種,接種量為每只0.2 mL/只。

1.4.3動物分組造模結(jié)束后，小鼠隨機分為模型組、化療組、六味組、六味化療組，每組10只。

1.4.4給藥模型組：接種24h后，以0.2mL生理鹽水灌胃，q12h；化療組：接種24h后，CTX以50mg/(kg·d)劑量隔日腹腔注射；六味組：造模前兩周即開始按22g/(kg·d)灌胃給藥，q12h；六味化療組：接種24h后，六味按22g/(kg·d)灌胃給藥，q12h，CTX以50mg/(kg·d)劑量隔日腹腔注射。2W后，處死各組小鼠。

1.5抑瘤率與脾指數(shù)的計算稱鼠重、瘤組織及脾臟重量，計算抑瘤率和脾指數(shù)，公式如下：抑瘤率=(模型組平均瘤質(zhì)量-給藥組平均瘤質(zhì)量)/模型組平均瘤質(zhì)量×100%，脾指數(shù)=脾臟重量/體重。

1.6免疫組織化學法腫瘤組織檢測MMP9、NF-kB蛋白的表達水平方法如下：組織切片、脫蠟、水化、洗滌、抗原修復、洗滌、滅活酶、洗滌、5%BSA封閉、一抗分別為MMP9(1∶100)、NF-kB(1∶100)，4℃過夜孵育14h；第2日室溫復溫3h后，PBS漂洗3×5min；加入二抗，4℃孵育50 min；漂洗，DAB顯色；漂洗，蘇木素復染，貼片，脫水和透明，中性樹膠封片。以LEICA倒置顯微鏡拍照，每張標本按順序選5個視野，Image-Pro Plus 6.0分析，用平均光密度(D)表示陽性物質(zhì)的相對含量。

2結(jié)果

2.1六味地黃湯聯(lián)合CTX對荷H22肝癌小鼠瘤重及脾指數(shù)的影響結(jié)果見表1。

表1　六味地黃湯聯(lián)合CTX

注：與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01;與化療組比較,#P<0.05,##P<0.01;與六味組比較▲P<0.05。實驗過程中，化療組及六味化療聯(lián)合組均有1只小鼠死亡。

結(jié)果表明：與模型組比較化療組及六味化療聯(lián)合組具有明顯的抑瘤作用(P<0.01)，六味組雖有一定的抑瘤效果但與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義，且六味化療聯(lián)合組的抑瘤作用優(yōu)于六味組(P<0.05)；六味組脾指數(shù)增大，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，六味組、六味化療聯(lián)合組的脾指數(shù)均高于化療組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。

2.2六味地黃湯聯(lián)合CTX對荷H22肝癌小鼠MMP9、NF-KB蛋白表達的影響結(jié)果見表2。

結(jié)果顯示：六味化療聯(lián)合組能減少MMP9蛋白的表達，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；化療組、六味組、六味化療組均能降低NF-KB蛋白的表達，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2六味地黃湯聯(lián)合CTX

組別nMMP9光密度NF-KB光密度模型組100.050±0.0230.145±0.065化療組90.039±0.0160.092±0.037**六味組100.043±0.0160.110±0.028*六味化療組90.034±0.012*0.092±0.016**

注：與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01；實驗過程中，化療組及六味化療聯(lián)合組均有1只小鼠死亡。

3討論

在人體的免疫系統(tǒng)中，NF-KB被認為是免疫系統(tǒng)最重要的轉(zhuǎn)錄因子，近年來的研究表明其異常激活也是導致腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵誘因之一[5]，能通過對相應基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，促進腫瘤的發(fā)生、腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[6]，亦可促使腫瘤產(chǎn)生放化療抵抗而影響治療效果。

而MMP9則被認為是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的一個重要分子標記，大量的實驗研究表明，其在癌細胞的快速增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的過程中起到很重要的作用[7-8]。其可通過降解ECM的分子物質(zhì)[9]、調(diào)節(jié)細胞的黏附性[10]、配合其他酶類降解血管基底膜和血管周圍基質(zhì)[11]等方式促進腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移，因此抑制其表達可能會有效地抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

基于六味地黃湯在臨床上已廣泛用于化療的輔助治療[12-13]以及趙益[14]將六味地黃湯用于BEL-7402肝癌細胞培養(yǎng)證實其體外有抑制肝癌細胞增殖的研究基礎(chǔ)上，我們將該方用于荷H22肝癌模型小鼠，探索六味地黃湯輔助化療藥物對肝癌細胞增殖及免疫功能的影響，并探討其輔助化療的協(xié)同機制。

本研究結(jié)果顯示，化療組及六味化療聯(lián)合組具有明顯的抑瘤作用，雖然兩藥聯(lián)用在抑瘤方面與化療藥單獨使用無明顯差別，但卻可以顯著提高肝癌動物的脾指數(shù)，增強其免疫功能。六味輔助化療治療肝癌，雖然對NF-kB蛋白表達無明顯影響，卻能顯著降低MMP9蛋白表達水平，有較好的協(xié)同作用，這將有可能減少腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

由此可見，六味地黃湯輔助環(huán)磷酰胺可提高肝癌動物的免疫功能，其抗肝癌的協(xié)同機制可能不是通過NF-KB，而是通過降低肝癌組織MMP9蛋白表達來實現(xiàn)。該研究結(jié)果可為六味地黃湯輔助化療藥物治療肝癌的臨床應用提供理論支撐。

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Effect of Liuwei Dihuang Decoction with Adjuvant Cyclophosphamide on MMP9, NF-kB Expression in H22 Tumor-bearing Mice

RAO Bin, XIE Bin, XIE Xiong, YU Gong, LIU Hong-ning

JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China

Abstract:Objective: To observe the effect of Liuwei Dihuang decoction(LW) with adjuvant cyclophosphamide(CTX) on MMP9, NF-kB expression in H22 tumor-bearing mice. Methods: 40 male Kunming mice were divided into model group, CTX group, LW group and the group using the LW and CTX,each group contained 10 mice. Animal models of H22 tumor- bearing mice was induced with the axillary injection of H22 cells, LW group started medication at molding two weeks before(22g/kg·d), CTX group(50mg/kg·2d) and the combination group started medication after molding. After 14d modeling, kill the mice and weigh, weighing the tumor tissue and splenic tissue, calculation of the antitumor effect and spleen index, testing the expression of MMP9,NF-kB protein on immunohistochemistry assay. Results: The CTX group and the combination group have obvious antitumor effects (P<0.01), and the combination group had better effect on antitumor than LW group (P<0.05). LW group Spleen index increased, the difference being statistically significant compared to the model group(P<0.05), LW group and the combination group spleen index all higher than CTX group (P<0.05 or P<0.01).Compared to the model group,the combination group have declined significantly on the expression of MMP9 (P<0.05); LW group, CTX group and the combination group all have declined significantly on the expression of NF-kB (P<0.05 or P<0.01). Conclusion: In this scheme of combination with chemotherapy for hepatocellular carcinoma , can improve the immune function ,the auxiliary mechanism of LW may not by NF-KB, but by reduced the expression of MMP9 protein in hepatocellular carcinoma tissue to achieve.

Key words:Liuwei Dihuang Decoction; Cyclophosphamide; Liver Cancer; MMP9; NF-KB

收稿日期：(2014-12-02)編輯：曾文雪

中圖分類號：R285.5

文獻標識碼：A