快速成型制備凝膠支架在組織工程中的應(yīng)用及進(jìn)展

潘　婷，曹曉東

(國(guó)家人體組織功能重建工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006)

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快速成型制備凝膠支架在組織工程中的應(yīng)用及進(jìn)展

潘婷，曹曉東

(國(guó)家人體組織功能重建工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006)

摘要：對(duì)于組織工程而言，如何將種子細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和生物刺激信號(hào)這3大要素完美結(jié)合,對(duì)于植入體的植入成敗至關(guān)重要。對(duì)于解決這一關(guān)鍵問(wèn)題，器官打印或組織打印作為一種新興的制備組織工程支架的技術(shù)，具有巨大的應(yīng)用前景。這種技術(shù)可以將包載生物活性因子(細(xì)胞及其他生物活性刺激信號(hào))的凝膠層層組裝，得到精確的三維結(jié)構(gòu)，并可控制生物活性因子的打印位置。而凝膠材料因其高含水率、優(yōu)異的細(xì)胞相容性及可控的降解速率等性能，成為最有應(yīng)用前景的生物打印材料。另一方面，通過(guò)快速成型技術(shù)這一強(qiáng)大的工具，可以制備得到具有精確內(nèi)外結(jié)構(gòu)，并包載多種活細(xì)胞或其它生物因子(生長(zhǎng)因子、基因等)的組織工程支架。然而，并非所有的快速成型方法均適用于凝膠成型。簡(jiǎn)單總結(jié)了可用于制備包載細(xì)胞凝膠支架的快速成型方法，進(jìn)一步討論了每種方法可用的凝膠材料類(lèi)型。凝膠材料較低的力學(xué)性能是限制其在生物打印方面應(yīng)用的一個(gè)重要缺陷，關(guān)于這一問(wèn)題及改進(jìn)的方法也做了初步討論。

關(guān)鍵詞：凝膠；快速成型；生物打?。唤M織工程；支架

1前言

迄今為止，組織器官的病變、缺損和移植一直以來(lái)都是臨床醫(yī)學(xué)亟需解決的一大難題[1]。傳統(tǒng)的修復(fù)方法是自體組織移植術(shù)，雖然可以取得滿意療效，但它是以犧牲自體健康組織為代價(jià)的方法，會(huì)導(dǎo)致很多并發(fā)癥及附加損傷；異體組織移植又面臨著供體器官來(lái)源極為有限、致命的免疫排斥反應(yīng)及一系列的并發(fā)癥等重重困難。自20世紀(jì)80年代科學(xué)家首次提出“組織工程學(xué)”概念以后[2]，為眾多的組織缺損、器官功能衰竭病人的治療帶來(lái)了曙光。組織工程是一個(gè)新興的正在成長(zhǎng)中的多學(xué)科交叉領(lǐng)域，結(jié)合生物醫(yī)學(xué)和工程學(xué)的方法，通過(guò)活體細(xì)胞或誘使內(nèi)源細(xì)胞來(lái)幫助組織形成或再生，從而恢復(fù)、維持或提高組織功能。

對(duì)于組織工程與再生醫(yī)學(xué)而言，如何將種子細(xì)胞、組織工程支架和生物刺激信號(hào)這3大要素完美結(jié)合對(duì)于植入體的植入成敗至關(guān)重要。對(duì)于無(wú)機(jī)材料和含水率較低的高分子材料，支架與細(xì)胞結(jié)合的方式只能通過(guò)支架成型后接種細(xì)胞。但研究證明這種結(jié)合方式的缺陷在于細(xì)胞的接種率較低，且無(wú)法控制細(xì)胞在空間上的分布[3-4]。為了提高細(xì)胞的接種率，并控制細(xì)胞的空間分布，可以將細(xì)胞包裹在支架材料中同時(shí)成型。該方法要求一個(gè)高含水量的細(xì)胞外微環(huán)境。

天然或合成的凝膠材料因其較高的水含量、優(yōu)良的生物相容性、可控的降解速率等，被認(rèn)為是最適合用于細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)或包載細(xì)胞的生物材料之一[5]。因此，近幾十年來(lái)，這類(lèi)凝膠在組織器官的修復(fù)與重建方面得到了廣泛的研究與應(yīng)用。由于凝膠的親水性，它們可以吸收比自身干態(tài)重量高達(dá)千倍的水分，形成化學(xué)穩(wěn)定或者可生物降解的膠態(tài)。然而，盡管凝膠有種種誘人的優(yōu)勢(shì)，它在應(yīng)用方面還是存在諸多限制。其中主要的一個(gè)缺陷在于使用傳統(tǒng)的方法很難將凝膠加工成預(yù)設(shè)計(jì)好的形狀和結(jié)構(gòu)[6]，而快速成型制備技術(shù)的出現(xiàn)可以很好解決這一難題。

快速成型技術(shù)(又稱(chēng)3D打印技術(shù)或增材制造技術(shù)) 是20世紀(jì)80年代后期開(kāi)始逐漸興起的一項(xiàng)新興制造技術(shù)，它采用離散/堆積原理，先由三維CAD軟件設(shè)計(jì)出組織工程支架的三維多孔結(jié)構(gòu)，然后將材料逐層沉積在平臺(tái)上[7-8]。3D 打印技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域也在隨著技術(shù)的進(jìn)步而不斷擴(kuò)展，包括生活用品、機(jī)械設(shè)備、生物醫(yī)用材料，甚至是活體器官。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，目前3D 打印技術(shù)在國(guó)際上已開(kāi)始被應(yīng)用于器官模型的制造與手術(shù)分析策劃、個(gè)性化組織工程支架材料和假體植入物的制造、以及細(xì)胞或組織打印等方面。該技術(shù)應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域的主要優(yōu)勢(shì)在于，可以得到具有100%連通性的多孔支架，且不僅支架的外型結(jié)構(gòu)，而且包括內(nèi)部連通孔的孔隙率和孔結(jié)構(gòu)，都可通過(guò)CAD-CAM軟件系統(tǒng)精確控制，從而可以保證細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和增殖，以及氧氣及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送[9]。再者，通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)備的精確控制，支架制備工藝的重復(fù)性好。

本文將重點(diǎn)闡述各類(lèi)適用于凝膠成型且能較為精確控制外部形狀和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的快速成型方法。文章不僅分析了各種方法的優(yōu)勢(shì)，同樣指出了當(dāng)前存在的一些問(wèn)題。

2制備凝膠支架的快速成型方法

快速成型技術(shù)根據(jù)其成型原理可大致分為3類(lèi)：①激光成型原理；②擠出成型原理；③噴印成型原理。激光成型原理利用光固化成型技術(shù)，通過(guò)激光引發(fā)聚合物交聯(lián)成型構(gòu)成組織工程支架。擠出成型原理是將具有一定黏度的熔融體材料在計(jì)算機(jī)控制下擠出、沉積，固化成型。噴印成型原理是在基底表面鋪上薄層粉體材料，通過(guò)噴印液態(tài)粘結(jié)劑將粉體融化粘結(jié)；或利用噴墨技術(shù)直接噴印材料成型。凝膠材料的成型要求較為溫和的工藝條件。因此，不是所有的快速成型方法均適用于凝膠材料的成型。本文主要介紹了上述3類(lèi)成型原理中適用于制備凝膠支架的快速成型技術(shù)。

2.1激光成型技術(shù)

2.1.1激光成型技術(shù)的工作原理及目前趨勢(shì)

除了選擇性激光燒結(jié)技術(shù)(SLS),其它激光成型技術(shù)均適用于凝膠成型。與擠出成型和噴射成型體系連續(xù)沉積材料不同，激光成型技術(shù)是將光能量連續(xù)打印在預(yù)設(shè)的圖案上。由此可知，只有使用可光交聯(lián)的預(yù)聚物才能得到交聯(lián)的凝膠網(wǎng)絡(luò)。

光固化立體印刷技術(shù)(SLA)SLA技術(shù)使用的原料為液態(tài)光敏樹(shù)脂，也可在其中加入其他材料形成復(fù)合材料。它是采用計(jì)算機(jī)控制下的紫外激光束以計(jì)算機(jī)模型的各分層截面為路徑逐點(diǎn)掃描，使被掃描區(qū)內(nèi)的樹(shù)脂薄層產(chǎn)生光聚合或光交聯(lián)反應(yīng)后固化，當(dāng)一層固化完成后，在垂直方向移動(dòng)工作臺(tái)，使先前固化的樹(shù)脂表面覆蓋一層新的液態(tài)樹(shù)脂，逐層掃描、固化，最終獲得三維原型[10](圖1)。工作臺(tái)的移動(dòng)高度要略小于每層的固化厚度，以保證接下來(lái)的一層能夠很好地與上一次粘接。后續(xù)處理步驟包括洗去多余的樹(shù)脂，大多數(shù)情況下還需要用紫外光束進(jìn)一步交聯(lián)固化。Arcaute等人[11]研究了通過(guò)改變激光強(qiáng)度、光交聯(lián)材料(PEG-DMA)和光交聯(lián)引發(fā)劑的濃度來(lái)調(diào)控層固化厚度。

微光固化立體印刷技術(shù)(μ-SLA)μ-SLA技術(shù)的原理可認(rèn)為與普通的SLA技術(shù)相同，不同之處在于兩種技術(shù)的精確度上的區(qū)別，μ-SLA精度更高，可制備從幾微米到厘米級(jí)別不等的構(gòu)件[12-13]。

圖1a為自下而上制備工藝原理圖。構(gòu)件在浸泡在樹(shù)脂液體下面的制造工藝平臺(tái)上自下而上逐層堆積成型，新的一層通過(guò)激光照射在前一層的上面固化。盡管這種制造工藝目前應(yīng)用最為廣泛[11,14]，但自上而下的制造方法也引起了越來(lái)越廣泛的研究興趣[10, 15-16](圖1b)。自上而下的制備裝置有一個(gè)透明的平板作為儲(chǔ)液器的底部。激光從裝置的底部引發(fā)光敏材料聚合，制造平臺(tái)朝激光照射的反方向移動(dòng)，逐層固化成型。通過(guò)這一方式，每一新固化層都出現(xiàn)在上一層的下部。將新成型的每一層從底部平板上分離要使構(gòu)件承受更大的機(jī)械力，但另一方面，引發(fā)聚合的表面不會(huì)直接暴露在空氣中(氧氣的存在會(huì)降低交聯(lián)率)，且不需要在構(gòu)件上覆蓋新的樹(shù)脂層，同時(shí)光照面可以一直保持光滑[10]。在SLA領(lǐng)域另一個(gè)應(yīng)用越來(lái)越廣泛的技術(shù)是數(shù)位光源式投射技術(shù)(DLP)[16-17]，工作原理如圖1b中自上而下制備工藝示意圖所示。該原理同樣也可用于自下而上的成型方法。DLP技術(shù)可使一整層的樹(shù)脂一次性固化，可以極大地提高加工速率。它包括一個(gè)數(shù)字微反射鏡裝置(DMD)，DMD由一系列鏡面組成，每個(gè)鏡面都可獨(dú)立地調(diào)整為開(kāi)或關(guān)閉狀態(tài)。這樣DMD可以作為動(dòng)態(tài)的光罩在表面投射出2D的圖案(可由微軟演示文稿文件設(shè)計(jì))。除了DMD，LCD也可作為動(dòng)態(tài)光罩[17-18]。但是考慮到光學(xué)填充因素和光透射，DMD的效果要更好一些[14]。

圖1　光固化立體印刷技術(shù)自下而上(a)和自上而下(b)制備工藝示意圖[10]Fig.1　Schematic diagram of bottom-up (a) and top-down (b) stereo- lithography setups. The bottom-up setup shown is an example of a system whereby the laser scans the surface for the curing of the photosensitive material. In the example of the top-down setup, dynamic light projection technology is used to cure a complete 2D layer at once[10]

雙光子聚合(2PP)2PP技術(shù)是目前越來(lái)越熱的一項(xiàng)激光成型技術(shù)。該技術(shù)同樣是利用光引發(fā)光敏材料發(fā)生交聯(lián)聚合。但與一般的單光子聚合技術(shù)不同，2PP技術(shù)通過(guò)波長(zhǎng)為800 nm的近紅外飛秒激光脈沖引發(fā)材料的聚合反應(yīng)[19](如圖2所示)。在聚焦點(diǎn)，光引發(fā)劑同時(shí)吸收波長(zhǎng)800 nm的雙光子，這樣雙光子可作為一個(gè)波長(zhǎng)在400 nm的單光子，從而引發(fā)聚合反應(yīng)[16]。這種非線性的激發(fā)特性只會(huì)激發(fā)聚焦點(diǎn)處的聚合反應(yīng)，其它區(qū)域并不會(huì)參與反應(yīng)，因此可以降低光源衍射對(duì)固化精度帶來(lái)的影響。移動(dòng)激光聚焦點(diǎn)可以構(gòu)建出3D結(jié)構(gòu)。該技術(shù)可以重復(fù)生產(chǎn)出微米尺寸的構(gòu)件，其精度可達(dá)到100 nm以下，這是其它快速成型工藝所不能實(shí)現(xiàn)的[20]。

圖2　雙光子聚合激光成型技術(shù)工作原理示意圖[19]Fig.2　Working principle of two-photon photo-polymerization. In the focal point of the near-IR laser beams, the photosensitive polymer is cross-linked. A ‘true’ 3D object is obtained[19]

2.1.2激光成型技術(shù)的缺陷及適用的凝膠材料

SLA技術(shù)常用于制備多孔的凝膠支架。Yu等人[21]研究了圖案化羥乙基甲基丙烯酸酯(HEMA)，通過(guò)干燥后再水化處理提高細(xì)胞的粘附性。起初該項(xiàng)技術(shù)用于制備單層凝膠結(jié)構(gòu)，目前也可以制備多層的多孔凝膠支架。Liu等人[22]用感光乳劑作為光罩，制備聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)三維凝膠支架。他們制備出了層數(shù)為3層、分辨率為幾百微米的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。連通的孔隙可使培養(yǎng)介質(zhì)傳送，有利于細(xì)胞的存活。但是這項(xiàng)工作耗時(shí)較長(zhǎng)，需要大量預(yù)先制備的光罩，而且并不完全自動(dòng)化。也有許多研究小組用PEG-DA作為初始材料[23-24]。Yasar等人[17]成功制備了尺寸為100 μm的復(fù)雜支架結(jié)構(gòu)。然而PEG-DA的溶脹性能限制了生產(chǎn)尺寸小于100 μm的構(gòu)件的可重復(fù)性。近期，很多工作致力于研究包載細(xì)胞的凝膠光固化成型。一些研究組報(bào)道了使用可光交聯(lián)的PEG包載細(xì)胞成型[22, 25]。

除了合成凝膠，一些天然凝膠也可通過(guò)SLA技術(shù)成型，如透明質(zhì)酸(HA)[26]和明膠[15]。然而，激光固化成型技術(shù)的主要缺陷包括必須要使用可光交聯(lián)的材料，限制了可使用的材料；且紫外光束會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一些影響[27]。

因?yàn)镾LA技術(shù)制備凝膠支架后處理步驟會(huì)帶來(lái)支架的收縮，因此該項(xiàng)技術(shù)的一大缺點(diǎn)就在于制備精度較低[28]。而且由于激光束的散射現(xiàn)象，當(dāng)制備尺寸較小的構(gòu)件時(shí)會(huì)發(fā)生較為嚴(yán)重的變形，制備的凝膠支架在移動(dòng)時(shí)易被損壞，而且必須要后期再光固化。為了解決SLA制備精度較低這一缺陷，通過(guò)改進(jìn)引進(jìn)了μ-SLA技術(shù)。例如，Barry等人[29]將直寫(xiě)成型技術(shù)與原位光引發(fā)交聯(lián)技術(shù)結(jié)合，制備了微米級(jí)別的凝膠支架。利用該技術(shù)，另一個(gè)課題組實(shí)現(xiàn)了精度在亞微米范圍的PEG-DA凝膠支架[30]。

為了得到分辨率小于細(xì)胞尺寸的三維支架，可以用2PP技術(shù)替代SLA技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)。鑒于2PP技術(shù)研究時(shí)間并不長(zhǎng)，因此在凝膠支架制備方面的研究報(bào)道并不多。例如，Schade等人[31]用該技術(shù)制備了結(jié)構(gòu)較好的類(lèi)凝膠支架。該支架由甲基丙烯酸化的聚氨酯和PEG-DA作為初始材料。Ovsianikov等人[32]同樣選擇PEG-DA作為初始材料制備了2PP三維支架。T.Billiet等人[33]用甲基丙烯酰胺修飾的明膠作為初始材料，通過(guò)2PP技術(shù)制備凝膠支架。

2.2擠出成型技術(shù)

2.2.1擠出成型技術(shù)的工作原理及目前趨勢(shì)

擠出成型技術(shù)包含很多成型技術(shù)，如熔融沉積技術(shù)(FDM)、多相噴射固化技術(shù)(MJS)、精確擠出成型技術(shù)(PEM)等等。這些技術(shù)都需要一個(gè)升溫熔融的過(guò)程，這不利于支架的生物活性，并不適用于凝膠材料的成型[7]。因此，研究者們提出了一些其它的成型技術(shù)來(lái)克服這一缺陷。下面介紹幾種在凝膠制備中應(yīng)用較多的擠出成型技術(shù)。

三維繪圖技術(shù)(3D-BioplotterTM)該技術(shù)由Landers等人于2000年提出[34](如圖3所示)。這一技術(shù)特別適用于軟組織工程支架的成型，并且簡(jiǎn)化了凝膠的成型加工過(guò)程。三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)建是通過(guò)計(jì)算機(jī)控制針頭在平臺(tái)上掃描、擠出材料，層層沉積成型。該技術(shù)不光能夠沉積成型連續(xù)的纖維，也可以成型不連續(xù)的點(diǎn)狀微粒。

圖3　三維繪圖成型技術(shù)(3D-BioplotterTM)工作原理圖[9]Fig.3　Schematic diagram of 3D-Bioplotter dispensing principle. In the 3D-Bioplotter system, the nozzle works pneumatically or via volume-driven injection. This also illustrates the principle of nozzle-based systems in general, where a nozzle is used for the deposition of material. Key difference with other nozzle-based systems is the ability to plot into a liquid medium with matching density, thus introducing buoyancy compensation[9]

液體的流出是通過(guò)氣壓擠出(氣動(dòng)針頭)或步進(jìn)電機(jī)(體積驅(qū)動(dòng)注射針頭)控制的。該技術(shù)的一大特色在于可以將一種黏性材料擠出沉積在密度相匹配的液態(tài)介質(zhì)當(dāng)中。低粘度的材料尤其適用這種基于浮力補(bǔ)償原理的沉積方式。因?yàn)楸苊饬思訜嵘郎氐倪^(guò)程，該技術(shù)可應(yīng)用于熱敏感的生物活性組分，也可以應(yīng)用于細(xì)胞的打印。纖維的直徑可以通過(guò)調(diào)整材料的黏度、沉積速度、針頭直徑和施加壓力等參數(shù)控制。大多數(shù)由該沉積方法制備的構(gòu)件都具有較為光滑地表面，這并不利于細(xì)胞的粘附及生長(zhǎng)。因此，進(jìn)一步地表面處理從而增強(qiáng)支架的細(xì)胞粘附性是必要的。Kim等人[35]改進(jìn)了Bioplotter設(shè)備，增加了一個(gè)可以在打印過(guò)程中產(chǎn)生振動(dòng)的壓電式轉(zhuǎn)換器。這樣打印出的PCL支架表面更加粗糙，細(xì)胞粘附性能更好。

壓力輔助微量調(diào)節(jié)注射技術(shù)(PAM)這一技術(shù)與FDM類(lèi)似，但沒(méi)有加熱的過(guò)程，由Vozzi等人提出[36]。設(shè)備包括一個(gè)5～20 μm的氣動(dòng)玻璃毛細(xì)注射器，可以在垂直面上下移動(dòng)，將材料沉積在基底上面?；卓梢栽谒矫嫔舷鄬?duì)于注射器平行移動(dòng)。材料的黏度、沉積速度、針頭直徑和施加壓力都會(huì)影響最終得到的沉積纖維的直徑。PAM技術(shù)打印支架的研究已經(jīng)有一些文獻(xiàn)報(bào)道[37-38]。近期，也有報(bào)道使用PAM技術(shù)成型凝膠支架的相關(guān)研究工作[39-40]。

低溫沉積成型技術(shù)(LDM)該技術(shù)由Xiong等人[41]于2002年構(gòu)想提出，并在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有很好的應(yīng)用。此技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)在于不需要對(duì)材料進(jìn)行加熱熔融處理[41]。利用低于0 ℃的溫度，可將材料溶液沉積在加工平臺(tái)上。材料可通過(guò)一個(gè)可以在XY-平面移動(dòng)的針頭擠出到可以在Z軸移動(dòng)的接收平面上[42]。LDM技術(shù)可以使用多個(gè)不同設(shè)計(jì)的低溫針頭，因此可以成型多相材料或梯度分層的多孔結(jié)構(gòu)[43]。LDM技術(shù)同樣可以加工生物活性分子，從而直接制備具有生物活性的支架。

直寫(xiě)成型技術(shù)(DIW)直寫(xiě)成型技術(shù)可以加工很多種類(lèi)的材料，且?guī)缀蹩梢猿尚腿我忸A(yù)設(shè)的結(jié)構(gòu)和外形[44-45]。膠體狀的“墨水”可以二維或者三維圖案化成型，且橫向分辨率比噴印成型技術(shù)或其他3D打印技術(shù)得到的結(jié)構(gòu)小至少一個(gè)數(shù)量級(jí)[46]。膠體凝膠裝載在一個(gè)安裝在z方向臂軸上的注射器中，通過(guò)一個(gè)圓錐形的針頭(φ100 μm～1 mm)擠出，在可移動(dòng)的x-y平臺(tái)上沉積成型。該技術(shù)所使用的墨水必須滿足兩個(gè)重要的條件：①墨水材料必須具有可控的粘彈響應(yīng)，當(dāng)材料從針頭中流出，要能立即在平臺(tái)上固化沉積，以保證能維持預(yù)設(shè)的形狀，即使遇到下層纖維之間的空隙也可維持自身的結(jié)構(gòu);②使用的墨水必須要有足夠高的膠體體積比例，以減小成型結(jié)束后干燥帶來(lái)的體積收縮[47-48]。

2.2.2適用于擠出成型技術(shù)的凝膠材料及存在的缺陷

海藻酸鈉[48-49]、明膠[50]、透明質(zhì)酸[51]、纖連蛋白[52]、基質(zhì)膠[49]、Pluronic?F127[53]等天然或人工合成凝膠都適用于擠出成型技術(shù)。目前，很多研究工作使用該技術(shù)研究凝膠包載細(xì)胞直接打印成型凝膠-細(xì)胞混合支架[54-56]。當(dāng)然各個(gè)技術(shù)也存在著一些缺陷。3D-Bioplotter制備的凝膠支架精確度較低且機(jī)械性能較差。Wong等人[57]證實(shí)材料的硬度可以影響細(xì)胞的鋪展和遷移速度。細(xì)胞在較硬的區(qū)域鋪展性更好，而在硬度較低表面遷移更快。另外，3D-Bioplotter對(duì)于不同的材料都要摸索優(yōu)化其打印參數(shù)，因此相較而言是一種比較耗時(shí)的成型技術(shù)。而DIW技術(shù)所使用的“墨水”，即凝膠體系必須要滿足前面提到的兩個(gè)重要的原則，在一定程度上限制了材料的選擇。

Khalil等人[58]組裝了一個(gè)使用4種不同微型噴管的多針頭低溫成型系統(tǒng)：氣動(dòng)微型閥、壓電式針頭、螺線管閥和精確擠出沉積(PED)針頭。該系統(tǒng)還包括一個(gè)氣壓供給裝置，并聯(lián)的氣動(dòng)閥可同時(shí)工作，從而在制備三維支架的同時(shí)達(dá)到多相沉積的目的。使用這個(gè)裝置可以制備多層的細(xì)胞-凝膠混合結(jié)構(gòu)[59]。PAM技術(shù)也可用于凝膠成型，且該技術(shù)是快速成型制備凝膠支架中橫向精確度最高的方法。研究證明這一技術(shù)的精準(zhǔn)性可與軟光刻蝕技術(shù)相媲美[60]。但是，如果要使用直徑很小的毛細(xì)注射管需要非常小心操作以免損壞注射管。而且要從很小的孔徑中擠出材料需要較大的壓力。

2.3噴印成型技術(shù)

2.3.1噴印成型技術(shù)的工作原理及目前趨勢(shì)

噴墨打印技術(shù)可以分為按需滴定法和連續(xù)噴印法。按需滴定體系使用電信號(hào)控制單個(gè)液滴的噴射。在連續(xù)噴印體系中，噴管在壓力的控制下將墨水連續(xù)噴出。噴出的液體分散成一系列小液滴，噴射方位由電信號(hào)控制[61]。兩種方法都可控制液滴粒徑在15 μm到幾百微米的范圍內(nèi)[61]。與擠出成型原理類(lèi)似，噴印成型技術(shù)也是通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助控制材料在平臺(tái)上層層沉積成型。

3DPTM美國(guó)麻省理工學(xué)院的Sachs教授開(kāi)發(fā)了3DPTM技術(shù)[62]。該技術(shù)是固相快速成型技術(shù)的典例。3DP技術(shù)可成型的材料的范圍很廣泛，包括陶瓷、金屬、金屬-陶瓷復(fù)合物和高分子材料。在固相快速成技術(shù)中，3DP技術(shù)是唯一可以用于凝膠材料的技術(shù)。3DPTM技術(shù)的原理如圖4所示。工作流程可分為3個(gè)連續(xù)的步驟：①粉體供給平臺(tái)升高，制備平臺(tái)降低；②滾軸推動(dòng)聚合物粉體在平臺(tái)上鋪展成一薄層；③噴頭噴射液體粘接劑，將粉體顆粒粘接。粘接劑可溶解或溶脹粉體顆粒，通過(guò)聚合物鏈段相互向內(nèi)擴(kuò)散或粘接劑直接滲透到粉體內(nèi)從而達(dá)到粘接的目的。重復(fù)循環(huán)這一連續(xù)步驟可層層組裝得到三維構(gòu)件。3DP技術(shù)一個(gè)很重要的因素就是要使用生物相容性良好的粘接劑。使用的粘接劑可以是純相的或者表面涂覆的，取決于成型支架的要求[63]。當(dāng)然，也可以使用單一組分的粘接劑或者多種粘接劑的混合物。當(dāng)制備過(guò)程完成，移除多余粉體，便可得到結(jié)構(gòu)復(fù)雜的三維支架。粘接體系必須要滿足的基本要求如下：①粘接劑溶液中粘接劑的含量要足夠高，但同時(shí)黏度不能太大以保證能從噴頭中噴出；②連續(xù)噴印要求噴頭最小化的導(dǎo)電性；③粘結(jié)劑必須能夠快速干燥或固化，這樣才能進(jìn)行下一層粉體的粘接。基于粉體的成型體系有一個(gè)很大的優(yōu)勢(shì)在于制備的支架表面比較粗糙，更適于細(xì)胞的粘附[61]。

圖4　典型的3DPTM制備裝置結(jié)構(gòu)示意圖[63]Fig.4　Schematic representation of a typical 3DP setup. A roller spreads a thin layer of polymer powder over the previously formed layer, and is subsequently solidified by the spatially controlled delivery of a liquid binder[63]

Zcorp公司研發(fā)了一種3D打印機(jī)(Z402),可以使用天然高分子材料，使用的粘結(jié)劑是一種水溶性墨水[64-65]。這為凝膠材料的打印創(chuàng)造了更大的發(fā)展空間。Utela等人[66]對(duì)粉體材料3DPTM技術(shù)成型做了詳盡的綜述，包括成型過(guò)程的各個(gè)步驟和粉體粘接劑的選擇及發(fā)生的反應(yīng)。

3DPTM技術(shù)可以從兩個(gè)不同的方面來(lái)實(shí)現(xiàn)構(gòu)件的形貌結(jié)構(gòu)：一是所能達(dá)到的最小單位尺寸；二是局部維度的可調(diào)整性[63]。這兩個(gè)方面很大程度上都依賴于粘接劑液滴和粉體顆粒間的相互作用?？刂品垠w與粘接劑之間反應(yīng)的參數(shù)包括：粉體材料本身的性質(zhì)、粉體表面處理工藝、粉體顆粒粒徑大小及粒徑分布、粉體顆粒的形狀、粉體堆積密度、粘接劑的性質(zhì)、粘接劑的黏度、粘接劑表面張力、液滴尺寸、液滴噴射速率、粉體和粘接劑的溫度以及周?chē)h(huán)境的溫度[61]。決定構(gòu)件最終精密度的因素包括：固化的每一層厚度的精確性，粘接劑液滴沉積位置的精準(zhǔn)程度，噴射的液滴分散鋪展的可重復(fù)性，伴隨著粉體粘接局部結(jié)構(gòu)改變的可重復(fù)性。有時(shí)會(huì)提到儀器的分辨率，這里分辨率指最小孔的孔徑和可得到最薄的層厚度[63]。

噴墨打印技術(shù)(Inkjet Printing)這一噴印成型技術(shù)包括所有液相噴墨打印成型技術(shù)。其中一些設(shè)備與3DPTM技術(shù)所用設(shè)備基本相同，將粉床換為液態(tài)凝膠前驅(qū)體即可[67]。還有一些與直寫(xiě)成型技術(shù)所用設(shè)備相同[68],若是直寫(xiě)成型技術(shù)，則無(wú)需粘接劑，液態(tài)材料自身沉積成型即可。

2.3.2噴印成型技術(shù)的缺陷及適用的凝膠材料

噴印成型技術(shù)被認(rèn)為是最不適用于凝膠支架成型的快速成型方法。但也有不少工作嘗試使用凝膠或凝膠與其他高分子材料的混合物三維成型，并取得了很多成果。

Landers等人[34]研究了使用水溶性高分子作為支架材料，用水溶性糖類(lèi)膠水粘接。盡管似乎可供選擇的粉體的種類(lèi)較多，但這項(xiàng)技術(shù)需要經(jīng)過(guò)燒結(jié)或固化的后處理過(guò)程，以提高支架的機(jī)械性能和穩(wěn)定性。

Lam等人[65]使用以淀粉為主體的混合粉體作為成型材料，混合粉體的組分為：玉米淀粉(50%)、葡聚糖(30%)和明膠(20%)，均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。而粘接劑材料使用的是去離子水。制備得到的支架為圓柱形(φ12.5 mm×12.5 mm)，內(nèi)部孔結(jié)構(gòu)為圓柱形(φ2.5 mm)或矩形(2.5 mm×2.5 mm)。使用水作為粘接劑可以避免有毒性的制備環(huán)境和支架殘留毒性的可能性。另一個(gè)使用水作為粘接劑的優(yōu)勢(shì)在于可以加入生物活性物質(zhì)(如生長(zhǎng)因子)或活細(xì)胞。支架成型后需要后處理操作，以提高支架的力學(xué)性，并且提高抗水溶性。支架在100 ℃干燥1 h后，浸泡入不同含量的共聚物溶液，含75%聚乙交酯和25%PCL的二氯甲烷溶液。

Xu等人[69]利用噴墨成型技術(shù)制備三維支架，所用的凝膠材料為纖連蛋白凝膠。纖連蛋白作為一種適用于三維打印的凝膠材料，用于構(gòu)建神經(jīng)修復(fù)的三維支架。纖連蛋白凝膠化通過(guò)加入凝血酶和CaCl2引發(fā)纖維蛋白原發(fā)生酶聚合反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。首先在平臺(tái)上鋪敷一層很薄的纖維蛋白原薄膜，之后通過(guò)噴頭在纖維蛋白原薄膜上噴印凝血酶。凝血酶可將纖維蛋白原快速凝膠化形成纖連蛋白凝膠。接下來(lái)在凝膠化的纖連蛋白上噴印一層NT2神經(jīng)細(xì)胞。整個(gè)過(guò)程重復(fù)5次，最終得到一個(gè)三維的神經(jīng)細(xì)胞-凝膠混合薄膜。

3DP技術(shù)制備凝膠支架目前亟需解決的問(wèn)題是提高精度和力學(xué)強(qiáng)度。3DP支架的分辨率很大程度上被支架的層厚所限制，層厚由設(shè)備在Z軸的分辨率和粉體的粒徑大小共同決定[63]。要提高3DP支架的精度，一方面要提高設(shè)備的分辨率，另一面與粉體的粒徑有很大的關(guān)系。然而，粉體的粒徑還會(huì)影響到粉體的流動(dòng)性，從而影響粉體在粉床上鋪展的均勻程度。因此一味地減小粉體的粒徑也不可行，粒徑太小的粉體的流動(dòng)性變差，在粉床上的鋪展也不好。要找到粉體粒徑和流動(dòng)性的平衡點(diǎn)，或是在保證較小粒徑尺寸下提高粉體的流動(dòng)性。Spillmann等人[70]用等離子體處理方法來(lái)提高粉體的流動(dòng)性，可以保證在較小粒徑尺寸(5 μm)的前提下得到鋪展更為均勻的粉層(如圖5所示)。而提高支架材料的力學(xué)性能一方面要從成型工藝入手，更重要的是要提高凝膠材料本身的性質(zhì)。成型工藝方面，可以通過(guò)優(yōu)化支架的結(jié)構(gòu)和使用合適的粘接劑來(lái)提高支架的力學(xué)性能。如何提高凝膠材料本身的力學(xué)性能在下面做一討論。

圖5　等離子體方法處理過(guò)的高流動(dòng)性的凝膠材料粉體照片(a)和均勻鋪展的粉層照片(b)[70]Fig.5　The images of high flowability of plasma treated 5 μm powders (a) and a homogeneous bed of the same powder (b)[70]

3提高打印凝膠的力學(xué)性能

對(duì)于組織工程支架而言，一個(gè)基本要求就是要有與所要修復(fù)的組織器官相匹配的力學(xué)強(qiáng)度，以在組織器官重建前能夠持續(xù)提供一個(gè)三維的空間支撐細(xì)胞的遷移及生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及代謝廢物的運(yùn)輸?shù)萚9]。例如，硬組織修復(fù)要求的力學(xué)強(qiáng)度在10～1 500 MPa范圍內(nèi)，而軟組織修復(fù)要求的力學(xué)強(qiáng)度為0.4～350 MPa[9]。

如前所述，凝膠材料的一大應(yīng)用缺陷就在于其較低的力學(xué)性能，這對(duì)臨床處理和體內(nèi)應(yīng)用帶來(lái)了極大的限制，因此提高凝膠材料的力學(xué)性能是至關(guān)重要的。對(duì)于快速成型制備的凝膠支架而言，通過(guò)使用光敏基團(tuán)修飾凝膠材料而后交聯(lián)處理是較常使用的方法。因此，有科研人員研究了可逆熱敏(在某一溫度范圍內(nèi)為凝膠態(tài)，高于或低于該溫度范圍為液態(tài))和光敏凝膠在3D打印構(gòu)建骨組織工程支架方面的應(yīng)用[71-72]。該研究工作所使用的方法為擠出成型技術(shù)，優(yōu)勢(shì)在于溫敏的凝膠可以在擠出后很快固化成型，而后光交聯(lián)的過(guò)程可以很好提高支架的力學(xué)性能和穩(wěn)定性(如圖6所示)。凝膠組分中其中一種為L(zhǎng)utrol F127 AlaL，是一種可光交聯(lián)的熱敏凝膠，由Schacht等人通過(guò)修飾Pluronic F127研發(fā)而得[71]。Lutrol F127 AlaL是由聚環(huán)氧乙烷和聚環(huán)氧丙烷聚合而成的三嵌段共聚物，并由可光交聯(lián)聚合的甲基丙烯酰胺基團(tuán)修飾。在聚合物溶液中加入光引發(fā)劑Irgacure 2959并光照引發(fā)聚合，可以提高凝膠的力學(xué)強(qiáng)度。而凝膠的降解性能也可通過(guò)改變化學(xué)組分而改變。更為重要的是，該凝膠材料還可以包載細(xì)胞同時(shí)成型。

圖6　擠出成型的Lutrol-TP 支架：(a) 組裝的三維結(jié)構(gòu)，(b) 成型的未光交聯(lián)處理的支架和 (c) 光交聯(lián)處理后的支架[71] Fig.6　Printed Lutrol-TP scaffolds：organized 3D structure (black arrowhead: vertical pores; white arrowhead: fused horizontal pores)， inset: total printed scaffold (a) , printed unphotopolymerized structure (b) and handling after photopolymerization (c)[71]

4結(jié)語(yǔ)

本文重點(diǎn)總結(jié)了可用于制備包載細(xì)胞的凝膠支架的快速成型方法，且進(jìn)一步討論了每種方法適用的凝膠材料類(lèi)型及目前應(yīng)用的趨勢(shì)及存在的缺陷。鑒于凝膠材料自身存在力學(xué)性能較弱的缺陷，本文在如何提高凝膠支架的力學(xué)性能方面做了一些討論。使用凝膠材料作為支架材料在于看好它可以較好地模擬細(xì)胞外基質(zhì)，可以包載細(xì)胞的同時(shí)成型。這樣更有利于研究細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)對(duì)細(xì)胞的作用，如細(xì)胞如何與ECM相互作用、改變ECM的構(gòu)型以及如何在ECM中遷移等。快速成型的方法可以更好地控制凝膠支架的內(nèi)外結(jié)構(gòu)，相較于傳統(tǒng)成型方法更具有應(yīng)用前景。但各種不同的快速成型技術(shù)仍然存在著一些應(yīng)用方面的缺陷，需要進(jìn)一步的改進(jìn)。

例如，可以結(jié)合多種不同的成型技術(shù)，以發(fā)揮各技術(shù)的優(yōu)勢(shì)、彌補(bǔ)不足。Moroni等人[73]將靜電紡絲技術(shù)(～納米級(jí)孔徑)和生物繪圖技術(shù)(～微米級(jí)孔徑)相結(jié)合，可以構(gòu)建含有多級(jí)孔徑結(jié)構(gòu)的支架。

另外，ECM是一個(gè)結(jié)構(gòu)、組分都很復(fù)雜的體系，單一網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和化學(xué)組分很難很好地模擬ECM。因此，更多的工作要致力于研究多種凝膠材料包載多種生物活性物質(zhì)(生長(zhǎng)因子、細(xì)胞等)同時(shí)成型，制備混合組分的支架。這樣才能更好地作為組織工程支架模擬細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)及組織的重建與修復(fù)。

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(編輯惠瓊)

《中國(guó)材料進(jìn)展》征稿啟事

《中國(guó)材料進(jìn)展》(CN61-1473/TG ISSN 1674-3962)為中國(guó)材料研究學(xué)會(huì)會(huì)刊，由中國(guó)材料研究學(xué)會(huì)主辦，中國(guó)工程院化工、冶金與材料工程學(xué)部協(xié)辦，西北有色金屬研究院承辦，化學(xué)工業(yè)出版社出版。主編由中國(guó)材料研究學(xué)會(huì)名譽(yù)理事長(zhǎng)周廉院士擔(dān)任。

《中國(guó)材料進(jìn)展》每期不同的材料專(zhuān)欄出版形式，使期刊特色鮮明；寬泛的材料領(lǐng)域前沿報(bào)道，使雜志成為一個(gè)國(guó)內(nèi)各材料領(lǐng)域研究人員進(jìn)行交叉學(xué)習(xí)、合作交流的良好平臺(tái)?，F(xiàn)已編輯出版了60多個(gè)材料專(zhuān)欄，涵蓋了近48個(gè)材料及其交叉科學(xué)研究領(lǐng)域。

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第一作者：鄭玉榮，男，1974年生，化學(xué)學(xué)士

特約專(zhuān)欄

第一作者：潘婷,女，1990年生，博士研究生

Progress in the Development of Hydrogel-Rapid Prototyping for Tissue Engineering

PAN Ting，CAO Xiaodong

(National Engineering Research Center for Tissue Restoration and Reconstruction, Guangzhou 510006, China)

Abstract：For tissue engineering, the combined actions of seeding cells, matrix and bioactive factors determine the eventual performance of the implant. Organ or tissue printing, a novel approach in tissue engineering, creates layered, biofactors (including cells and other bioactive stimuli)-laden hydrogel scaffolds with a defined three-dimensional (3D) structure and organized biofactors placement, which is seen as a great promise. To this end, hydrogels represent to be the most promising materials for bioprinting because of their high water content, excellent cytocompatibility and tunable biodegradability. On the other hand, rapid prototyping (RP) techniques have become a powerful tool to produce a scaffold of the desired shape and internal structure with encapsulation of multiple living cell types or other biofactors, such as growth factors and genes. However, not all kinds of RP techniques are suitable for generation of hydrogel scaffolds or cell encapsulation. Therefore, in this review, we give a brief summary of different rapid prototyping techniques suitable for the production of hydrogel scaffolds. Each technique is further discussed in terms of the different hydrogels used. One major limitation has yet to be addressed is the poor mechanical strength of hydrogel scaffolds. This problem and probable solution are also discussed in this review paper.

Key words：hydrogels; rapid prototyping; bioprinting; tissue engineering; scaffold

中圖分類(lèi)號(hào)：R318

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1674-3962(2015)03-0236-10

DOI:10.7502/j.issn.1674-3962.2015.03.06 10.7502/j.issn.1674-3962.2015.03.07

通訊作者：曹曉東,男,1965年生，博士，教授，Email：caoxd@scut.edu.cn 吳新年，男，1968年生，理學(xué)博士、研究員，Email:wuxn@lzb.ac.cn

收稿日期：2014-07-25 2014-04-10