基于融合蛋白的生物材料及其在組織工程中的應用

張　妍,許　可,高　超,楊　軍

(南開大學生命科學學院 生物活性材料教育部重點實驗室,天津 300071)

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特約專欄

第一作者：張妍，女，1988年生，博士研究生

基于融合蛋白的生物材料及其在組織工程中的應用

張妍,許可,高超,楊軍

(南開大學生命科學學院 生物活性材料教育部重點實驗室,天津 300071)

摘要：模似生物體組織的結構與狀態、研制細胞與支架材料三維復合體，將有望開發出用于修復受損組織和器官的生物替代品。細胞的正常生物活動需要來自細胞外微環境中的信號分子持續刺激。作為人工細胞外基質的重要組成部分，材料的物理及化學信號能夠影響細胞基因及蛋白表達，但遠不足以達到體外重建組織器官的長遠目標。利用基因與蛋白質工程技術對天然蛋白結構進行融合改造，設計并生物合成具有多重結構與功能的融合蛋白生物材料,可用于改善天然或化學合成生物材料的生物活性。綜述了國內外基于融合蛋白的生物材料發展動態，概括了融合蛋白的設計思路與制備技術，重點詳述了與細胞生長因子以及細胞粘附因子相關的融合蛋白在組織工程領域的應用。

關鍵詞：融合蛋白；組織工程；細胞外基質；細胞外微環境；血管化；干細胞

1前言

組織工程的核心是建立由細胞和生物材料構成的功能化三維復合體[1]。生物材料作為人工細胞外基質，形成了組織工程種子細胞的細胞外微環境模板。材料本體及其表面理化性質誘導產生的生物學效應不僅決定了生物材料的安全性，也對細胞的形態、增殖與分化以及組織結構、功能的修復與重建具有重要的調控作用[2]。隨著組織工程和再生醫學的快速發展，設計開發具有良好生物相容性、結構與功能仿生天然細胞外基質的生物材料，正在成為材料科學和生命科學共同關注的研究熱點。

縱觀生物材料的發展，經歷了第一代惰性材料，第二代具有活性或降解性質的材料，現已發展到兼具可降解和生物活性的第三代生物材料，并開始從生命科學的角度研究和設計生物材料的分子結構與功能[3]。其中，蛋白質是以氨基酸為基本單位構成的具有一定空間結構的天然高分子，是生命活動的主要承擔者。機體內細胞外微環境中各種細胞外基質蛋白、酶以及多種細胞因子等蛋白組分，通過協同調控多個細胞信號通路，參與組織器官的發生、發育以及功能表達、修復等一系列生命活動，是人體組織更新和修補的主要物質基礎。通過組織和細胞水平上的生物操作，模擬自然組織的結構與狀態，將細胞與天然或人工合成的支架材料結合起來，將有望研發出用于修復或改善缺損組織和器官的生物替代品(圖1)[4]。目前，已有多種蛋白(如膠原、纖維蛋白、細胞生長因子等)廣泛用于組織工程支架的研究，表現出改善組織工程支架與種子細胞的相互作用，促進并誘導組織再生及其結構與功能的重建的優良性質。然而天然蛋白多由動物組織分離提純獲得，且病毒感染、抗原反應、結構與功能的穩定性和機械強度不足等問題，仍始終制約著天然蛋白在組織工程中的進一步開發與應用[5]。

圖1　仿生構建細胞外基質調控細胞行為示意圖[4]Fig.1　Schematic diagram of biomimetic extracellular matrix regulating cell behavior[4]

近年，基于基因和蛋白質工程原理與技術，人們根據特定組織的需要(如目標蛋白的分子量大小、序列、功能組成等)將編碼目標蛋白的DNA分子進行“剪切”、“拼接”設計重組基因序列，不僅實現了生物合成具有可控結構與多重功能的融合蛋白，并且其用于制備具有特定生物學功能的仿生人工細胞外基質的研究，也取得了很大進展，為人們體外構建功能性組織或器官提供了新的發展機遇[6]。如今已經得到學者普遍關注的的融合蛋白主要有結構蛋白構成的融合蛋白(如具有彈性蛋白、絲蛋白特性的重組蛋白)、細胞生長因子的融合蛋白、以及細胞粘附因子(如整合素、Ca粘素等)的融合蛋白[7]。本文將重點介紹基于細胞生長因子以及細胞粘附因子融合蛋白的生物材料及其在組織工程中的應用。

2基于融合蛋白的生物材料結構設計與制備

用于組織工程的材料不僅為組織再生提供結構支持，還要綜合考慮體內溫度、pH及細胞粘附、增殖、遷移等因素，并應滿足細胞增殖與材料降解的動態平衡[8]。基于蛋白的生物材料能夠以生物化學信號引導細胞行為，因而其生物活性片段的種類、結構、結合及釋放的調控在材料開發過程中均至關重要。蛋白材料用于生物材料的生物功能化改性方法主要有物理吸附、共價固定、材料包封等，但這些方法均有明顯的缺陷。在自組裝和生物技術領域，重組DNA的方法為新一代蛋白質生物材料的發展奠定了基礎(圖2)[9]。目前常用的融合蛋白生物材料主要有以下3種設計思路：①改變粘附蛋白及多肽片段的種類；②調整蛋白及多肽片段的密度和空間分布；③優化蛋白及多肽片段的時間可控性。

2.1融合蛋白的結構設計

圖2　模擬天然ECM構建復雜生物材料的設計策略[9]Fig.2　Design strategies for the creation of synthetic biomolecular materials that mimic the complexity of natural ECMs[9]

構建融合蛋白的基本方法是將具有特定功能的天然或人工編碼的多肽序列模塊化,并使用基因編碼的DNA序列模板合成[10]，隨后將第1個蛋白的終止密碼子刪除，再接上帶有終止密碼子的第2個蛋白基因，以實現兩個基因的共同表達。通過控制每一個功能肽模塊在整體蛋白材料中的確切位置和密度，人們便能夠根據實際需要改變融合蛋白的組成。融合蛋白的設計大致分為基于重復結構、基于生長因子以及基于細胞粘附分子3類(表1[11])。第1類融合蛋白中最典型的是來源于彈性蛋白(Elastin-Like Polymers，ELPs)及絲素蛋白(Silk-Like Polymers，SLPs)的融合蛋白。ELPs是一種由數個重復的氨基酸序列組成的細胞外基質蛋白，由兩種短肽段交替排列構成，主要包括VPGZG、VPGVG、APGVGV、VPGFGCGAG以及VPGG等5種[12]。最著名的當屬VPGZG

融合蛋白(Z可換為除了脯氨酸外任意氨基酸)。重復的VPGVG序列能夠使融合蛋白具有溫敏特性[13]，將溫敏性ELP與化學、酶、物理等多種交聯方式的水凝膠結合起來能夠衍生出多種應用方式。ELPs主要由甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸組成，極易形成反向平行的β-折疊片層結構，具有多樣側鏈化學修飾位點，良好的熱穩定性和機械性能，在生物醫學上常用作手術縫合線，人工皮膚及軟骨修復材料[14]。對于此類融合蛋白，只需通過調節其氨基酸序列和分子鏈長度，便能夠精確控制其對溫度、pH、離子強度的響應敏感性，從而實現可逆的溶解轉變[15]。

表1　蛋白質工程生物材料中常用的肽段序列[11]

目前對于生長因子及細胞粘附因子功能域多肽的篩選研究尚未取得突破，因此基于全長蛋白分子的融合蛋白，通過具有特異材料親和性的蛋白片段賦予其新功能的設計理念仍屬主流。例如，將蛋白分子連接在膠原蛋白結合域[16]和免疫球蛋白Fc段[17]上制備的融合蛋白，不僅能提高蛋白與多種支架材料親和性，還能夠大大延長這些因子的半衰期，并使其長期發揮效用。膠原蛋白是細胞外基質的主要成分，作為細胞生長的依附與支架，能誘導上皮細胞等的增殖和分化。在膠原酶的膠原結合區中有一段肽序列為 TKKTLRT，具有特異的膠原結合能力，被命名為膠原結合區 (Collagen Binding Domain, CBD)。采用基因工程的方法，在生長因子上融合CBD能夠賦予生長因子更強的特異結合膠原蛋白的能力。從而制備適用于不同組織損傷修復的功能性膠原生物材料[18]。基于以上原理，戴建武教授課題組[19]進一步開發出能夠特異性結合細胞外間質中一種非膠原性結構蛋白——層連蛋白的多肽片段(Laminin Binding Domain, LBD)用以融合蛋白設計，并將其應用于大鼠坐骨神經損傷模型，表明該片段能夠維持神經生長因子(NGF)的活性，并定位于天然神經細胞外基質成分的層粘連蛋白且持續集中在神經損傷部位，以提高周圍神經再生(圖3)。免疫球蛋白(IgG)，由4條肽鏈組成的對稱結構組成。4條肽鏈有兩條重鏈和兩條輕鏈，鏈間具有二硫鍵，根據各結構的氨基酸組成和功能的不同，分為可變區和恒定區，位于肽鏈N端的是可變區結合抗原，恒定區在肽鏈C端，稱為Fc段。Fc段可與其他多種蛋白結合，構建基于Fc的融合蛋白，可作為純化標簽使用，半衰期持久，可介導ADCC及CDC作用 ，在藥物和疫苗研發、蛋白純化等諸多領域有著十分廣泛的應用[20]。

圖3　坐骨神經損傷大鼠植入材料7 d后神經恢復情況[19]Fig.3　Recovery of sciatic injury rat after biomaterials implanted for 7 d[19]

2.2融合蛋白的制備

基于重復結構的融合蛋白大多為短肽，不具有復雜的空間結構，因此只需簡單的多肽合成過程即可獲得目標蛋白。由單個氨基酸合成多肽主要通過兩個氨基酸之間脫水形成肽鍵來實現，主要包括以下基本步驟：首先對兩性離子結構的氨基酸進行相應的氨基或梭基保護，其次將羧基活化為活性中間體，待耦合過程結束后，對肽鏈上氨基酸的保護基團選擇相應的方式進行選擇性的脫除或者是全脫除。目前常用的多肽合成方法為液相合成和固相合成兩種。液相合成法是將所需的氨基酸配制成溶液，并對其中一個氨基酸的氨基、其余氨基酸的羧基和不參與反應的側鏈基團進行化學基團保護，只活化參加反應的氨基酸的羧基，待耦合反應完成后再將沒有參加反應的原料、活化劑等分離除去，得到純化多肽產物。這種方法雖然操作繁瑣，卻具有目標產物純度高的優勢。而固相合成法，則是將多肽序列C端的第1個氨基酸的羧基通過酯化反應固定于不溶性的樹脂上，進而以此氨基酸作為氨基組分，脫除其氨基保護基團并同過量的活化后的羧基組分耦合形成肽鍵，重復脫保護、縮合、洗滌過程持續合成，獲得所需的肽鏈。合成完成后，再試用三氟乙酸將產物從樹脂上切割下來，同時脫除所有保護基團，純化回收獲得所需多肽[21]。

相對來說，具有一定空間結構且序列復雜的其他兩種融合蛋白的合成過程則復雜得多。精確構建所需DNA模版是保證融合蛋白多樣性及穩定性的基礎。在獲得目標DNA序列后，將其連接進入特定的載體之中,以獲得充足融合蛋白質粒,見圖4[22]。由于遺傳基因的簡并性，同一種融合蛋白可對應著多種DNA序列，但序列合成蛋白效率卻與擴增時選取的宿主種類有關(大腸桿菌、酵母菌及真核細胞等)。例如，“AAG及AGA”片段如果出現在需要使用大腸桿菌表達體系的質粒中便會大大影響蛋白產率[23]。當然，重組質粒中密碼子的優化還有許多影響因素——密碼子偏倚、tRNA可用性、mRNA穩定性和mRNA結構都在基因表達中起重要作用，而且選擇DNA片段時也應盡量避免在重組基因載體中存在高度重復的部分以避免發生錯配，影響mRNA轉錄[24]。

圖4　重組融合蛋白制備與應用流程[22]Fig.4　Flow chart of the preparation and application of recombinant fusion protein[22]

最優化后的DNA序列需要引入到合適的生物體中表達。大腸桿菌是目前最常用的表達系統，相對便宜、擴增迅速，并且可以通過基因修飾提高蛋白表達水平。但由于大腸桿菌為原核生物，沒有高爾基體和內質網結構，無法對重組蛋白進行轉錄后修飾(糖基化)，且重組蛋白過表達會產生包涵體，需進一步處理以恢復蛋白活性。酵母菌也是廣泛應用于重組蛋白表達的宿主，同樣具有易于擴增、費用低廉的優勢，屬真核表達體系，能夠對重組蛋白進行修飾。但酵母菌的蛋白糖基化仍與哺乳動物有較大差異，使用昆蟲細胞及哺乳動物細胞表達的重組融合蛋白往往與天然蛋白的結構和功能更為接近[25]。一般來說，重組融合蛋白的表達效果越好，所需的轉染及細胞擴增過程便越復雜，所需時間和成本也就越高。

3基于融合蛋白的生物材料在組織工程中的應用

3.1基于細胞生長因子的融合蛋白生物材料在組織工程中的應用

正常細胞的生物活動受到細胞外微環境中信號分子的持續刺激與調控，同時細胞也會通過分泌多種因子，使其微環境更利于其增殖、分化及功能表達[26]。生長因子作為細胞之間的信號傳導分子調控多種細胞行為，其由多種細胞分泌，并與靶細胞表面的特異性受體結合而發揮作用，能夠促進細胞增殖、分化和功能表達，在傷口愈合和組織再生過程中具有重要作用[27]。然而，大多數生長因子在體內均具有容易自由擴散且難以長期保持穩定的特點，在機體內存在潛在的風險，并影響組織修復[28]。如圖5所示，將生長因子固定于生物材料的本體或表面，能夠顯著改善其穩定性并控制其定量持續對細胞形成刺激[29]。

圖5　材料表面固定化生長因子與細胞相互作用示意圖[29]　Fig.5　Schematic diagram of cell interactions with surface immobilized growth factors[29]

3.1.1EGF融合蛋白

EGF(表皮細胞生長因子)是由53個氨基酸組成的單鏈多肽，能夠啟動DNA復制，促進細胞增殖及蛋白合成，促進傷口愈合及上皮組織角質化[30]。由于表皮生長因子受體(EGFR)在腫瘤生長、侵襲和轉移過程中起著重要作用，并在相當一部分人類腫瘤中均有表達，其配體EGF更多地應用在抗癌藥物靶標，應用于腫瘤靶向治療。Yang Xiaoping[31]等將EGF與改性白喉毒素(Diphtheria Toxin，DT)通過組-丙氨酸相連，所得融合蛋白能夠對早期膀胱癌細胞進行靶向定位和治療，經由動物實驗證明有效且無全身毒性反應。Lan Keng-Li[32]等構建了具有放射性標記的VEGF-EGF融合蛋白并作為雙靶向劑用于癌癥診斷和治療，也取得了相似結論。

3.1.2FGF融合蛋白

bFGF(堿性成纖維細胞生長因子)是由150～200個氨基酸組成的多肽，相互之間的氨基酸序列有20%～50%是相同的,其中心區域有大約120個氨基酸序列存在高度的同源性。它是一種重要的信號分子，參與調控許多胚胎發育和器官形成過程，如原腸胚時期細胞遷移，中胚層形成，以及腦、肺、腎、肢體等器官發育[33]。同時，它也具有促進纖維原細胞和內皮細胞增殖的作用，調控組織創傷修復。Hashi H實驗室[34]構建了由纖連蛋白和堿性成纖維細胞生長因子的細胞結合結構域的融合蛋白，并將其固定于培養皿表面以及膠原水凝膠中,用于HUVEC細胞培養，實驗結果表明，該融合蛋白能夠刺激HUVEC的生長并刺激雞胚中絨毛尿囊膜的血管生成。有學者將膠原蛋白結合域(Collagen Binding Domain，CBD)與bFGF結合起來制備CB-bFGF融合蛋白，能夠在體外培養中促進骨髓間充質干細胞增殖，且在與可注射的膠原蛋白粉末混合后用以治療鼠骨折，較單純使用bFGF用量更低，效果更佳[35-36]。

3.1.3HGF融合蛋白

HGF(肝細胞生長因子)是一種旁分泌細胞因子，是具有調節細胞存活、形態、粘附、遷移等功能的多效生長因子，參與胚胎器官發育、成人組織再生及傷口愈合過程。此外，HGF與其受體c-Met與癌細胞增殖、轉移也高度相關[37]。日本Takashi Kitajima實驗室[38]將HGF與膠原結合域結合起來構建CBD-HGF融合蛋白。實驗表明，相較于液態添加HGF，固定化CBD-HGF可穩定融合生長因子結構、延長因子活性、更長時間地促進內皮細胞(ECs)生長。此外，該課題組還將該融合蛋白應用于大鼠頸動脈球囊損傷的治療，發現結合有CBD-HGF的膠原支架能夠更好地促進體內損傷部位內皮化及內膜形成[39]。同樣地，赤池敏宏課題組[40]將HGF與IgG的Fc段融合構建而成的HGF-Fc融合蛋白不僅能夠促進Hepg2細胞在材料表面的粘附及伸展(圖6)，還可調控細胞PI3-k及AKT、ERK磷酸化信號通路活化。

3.1.4VEGF融合蛋白

VEGF(血管內皮細胞生長因子)是一種具有肝素結合活性的同源二聚體糖蛋白，能夠特異性作用于血管內皮細胞。VEGF165是其最常見的亞型，具有誘導內皮細胞增殖、遷移、功能表達等作用，并參與體內創傷愈合、慢性炎癥、腫瘤的血管增生過程。它主要從兩個方面參與血管新生：①作為血管內皮細胞分裂素，促進NO釋放，提高血管滲透性和擴張性；②產生細胞趨化作用，募集游離細胞形成細胞群[41]。于美華等[42-43]利用基因重組技術構建了具有VEGF165與免疫球蛋白IgG的Fc功能域基因序列的質粒載體，經真核細胞體系表達、純化得到了VEGF-Fc融合蛋白。研究結果表明，VEGF-Fc經Fc的疏水結合可在聚苯乙烯平板表面穩定形成VEGF蛋白層，不僅顯著改善聚苯乙烯平板的表面親水性，而且有效提高了平板表面HUVEC細胞粘附，并促進HUVEC增殖以及vWF和VE-cadherin的表達；細胞骨架染色結果顯示：細胞絲狀偽足豐富，肌動蛋白纖維轉化為較大的應力纖維，有利于微血管網絡的形成(圖7)。此后，祝傳順等[44]進一步將VEGF-Fc用于PCL多孔支架表面改性，發現其能夠顯著改善PCL支架表面親水性，提高支架吸水速度及吸水量，同時誘導細胞快速增殖、均勻地浸入支架內部，并保持良好細胞活性。

圖6　HGF-Fc固定化平板及普通板培養的表面HepG2細胞骨架染色的顯微照片，圖(b)，(c)是圖(a)中方框區的放大[40] 　　Fig.6　Micrographs of cells skeleton staining of HepG2 cells cultured on HGF-Fc immobilized plate and normal plate,figure (b),(c)are magnification of square zone in figure (a)[40]

圖7　VEGF-Fc基質化平板培養HUVEC細胞的vWF表達：培育1 h(a)， 48 h(b)[42-43]Fig.7　The vWF expression of HUVECs cultured on VEGF-Fc coated plate:cultured for 1 h (a) and 48 h (b) [42-43]

3.2基于細胞粘附因子的生物材料在組織工程中的應用

細胞-細胞、細胞-細胞外基質間相互作用也是細胞外微環境的重要組成部分，主要包括Ca粘素蛋白家族、整合素家族等，其可介導細胞-細胞間特異性鏈接以及細胞-基質間非特異性連接[45]。目前,細胞粘附分子可以分為5類,分別為整合素家族、Ca粘素家族、免疫球蛋白超家族、選擇素家族及其他家族(如透明質酸粘素、血管附著素族粘附分子、H-細胞粘附分子超家族等)[46]。整合素是細胞表面受體的一大家族，包含由14種α及8種β兩大類亞單元構成的20多種雜二聚體跨膜蛋白，參與細胞選擇性粘附及信號傳遞，進而調控細胞的生長、增殖和凋亡。目前較為成熟的一類重組蛋白材料RGD短肽的主要受體便是整合素家族。RGD序列由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸組成，是細胞外基質中與細胞粘附相關的多種糖蛋白共同含有的高度保守序列，也是整合素受體可以識別的最小多肽序列。RGD序列于20世紀80年代發現并實現了人工合成，至今已在多種生物材料改性中應用，其可在短期內促進細胞的粘附、遷移和生長。但在長期體外培養及體內實驗中,RGD肽的變性、脫落以及肽鏈的構象改變仍有待進一步研究解決[47]。

細胞Ca粘素蛋白是粘著連接的重要組成成分，最早被認為是一種Ca2+依賴性的粘附蛋白分子，以多種形式分布于不同組織中[48]。Ca粘素蛋白為I型跨膜蛋白，其胞外域由5個結構域組成，胞外近N端為Ca2+結合部位，其胞內域與α，β，p120連環蛋白等分子結合，并與骨架蛋白相結合[49]，其不僅通過蛋白胞外域的同源結合介導細胞間連接，并參與調控細胞的分化和遷移，在細胞組織化過程中起著重要作用(圖8)[50]。以下將重點介紹Ca粘素融合蛋白在組織工程中的研究及應用現狀。

圖8　Ca粘素胞內信號通路示意圖[50]Fig.8　Schematic diagram of cadherin intracellular signaling pathways[50]

3.2.1Ca粘素融合蛋白對功能細胞的影響

AKaike T課題組[51]率先構建了鼠源E-cadherin胞外域和IgG蛋白Fc結構域的重組蛋白mE-cadherin-Fc。實驗結果表明，與膠原對照，鼠肝原代細胞能夠在細胞膜蛋白E-cadherin介導下更好地粘附于mE-cadherin-Fc涂膜的平板表面，且細胞DNA合成活性降低、色氨酸合酶的表達保持不變。Fauke等[52]同樣通過構建重組質粒轉化表達得到了E-cadherin-Fc重組蛋白，并將此重組蛋白制備成基質材料,考察MDCK細胞粘附和形態的影響。Johana等[53]將N-cadherin-Fc融合蛋白通過固定劑PHMAA-g-PEGNHS固定于聚苯烯酰胺水凝膠及丙烯酰胺取代的玻璃表面，發現N-cadherin能夠調控皮層及膠質細胞粘附，同時對神經突的生長有明顯促進作用.此外，Koki等[54]還將N-cadherin利用桿狀病毒-脂質體膜融合方法與脂質體相結合應用于藥物傳遞系統，發現N-cadherin脂質體能均勻粘附于LN-229膠質瘤細胞膜表面，展示了N-cadherin脂質體作為納米載體生物材料用于腫瘤治療的潛能。由于細胞微環境的復雜性，還有不少研究者考察了多種細胞粘附因子融合蛋白材料對細胞功能的影響。如Behiati等[55]將L-selectin-Fc和VE-cadherin-Fc共同固定于Ti材料表面，大大提高了EPC和HUVEC細胞的粘附、細胞活性、細胞增殖潛能。Jorge等[56]首先制備了具有控制神經細胞粘附和生長功能的聚(3.4-乙烯二氧噻吩)：聚(4-硫磺酸)-co-順丁烯二酸(PEDOT：PSS-co-MA),固定在金基質和碳微纖維表面，隨后將N-cadherin和L1重組蛋白修飾在PEDOT：PSS-co-MA上，結果表明,該材料能顯著促進神經生長和遷移。由此可見，基于Ca粘素家族構建的融合蛋白能夠穩定吸附于多種基質材料表面，應用形式豐富，均表現出與體內相似的功能特性，對不同細胞的粘附、增殖及功能表達起到良好的促進作用。

3.2.2Ca粘素融合蛋白對干細胞分化的影響

干細胞是具有高度自我更新及多向分化潛能的細胞，具有構建復雜組織器官的可能。將分離的干細胞在某種刺激下形成新的組織用于替代損失的器官或組織，即干細胞治療法已進入臨床實驗階段，但在干細胞治療過程的不確定性和不可控性仍然是這一技術的主要瓶頸[57]。因此，開發能夠“控制”干細胞命運的生物活性材料具有極高的臨床價值和應用前景。

Bian等[58]將N-cadherin加入到丙烯酰胺-透明質酸水凝膠中培養間充質干細胞(MSC)，發現N-cadherin在體外培養及體內實驗中均表現出促進MSC向軟骨分化及產生特異軟骨基質的作用。Zhang等[59]利用纖連蛋白III7-10片段與cadhrin11胞外域1和2片段構建融合蛋白rFN/CDH，并將其固定在磷酸氫鈣陶瓷表面，發現該融合蛋白能夠促進MSC在活性材料表面的粘附、增殖及成骨分化。而后，他們又利用層層(lbl)自組裝的方法構建了BCP/lbl/Chi-rFN/CDH緩釋材料，探究骨髓間充質干細胞在材料表面的粘附和增殖能力，發現MSC的成骨分化能力明顯提高[60]。AKaike課題組[61]使用mE-cadherin-Fc基質培養鼠源胚胎干細胞，誘導其向肝實質細胞定向分化，所得分化后細胞形態與功能上均與肝原代細胞十分接近。此外，他們還將E-cadherin-Fc和N-cadherin-Fc共同涂膜，獲得了表達βⅢ-tubulin，pax6和Tyrosine Hydroxylase等神經元陽性標志蛋白，而不表達神經膠質指標蛋白，獲得了具有高同源性的原始外胚層和神經祖細胞[62]。由此可見，基于Ca粘素家族融合蛋白的基質材料能夠模擬細胞與細胞間相互作用，刺激細胞產生分子水平的響應性變化，最終達到調控干細胞增殖與分化的目的。

與胚胎干細胞相比，間充質干細胞具有來源廣泛、免疫原性低、無倫理問題等獨特優點，現已成為再生醫學領域最受關注的細胞[63]。然而隨著體外培養的MSC細胞不斷傳代擴增，其增殖及分化潛能也會逐漸降低[64]。因此要真正將MSC細胞在臨床治療中應用并推廣，則必須開發能夠獲得大量維持干性的MSC的體外培養體系。已有研究發現在纖維粘連蛋白涂膜的培養皿中培養MSC能夠更好地維持細胞多向分化潛能[65]。因此，模擬體內干細胞生長微環境，構建人工細胞外基質，將會成為解決這一問題的最有效手段之一。通過生物材料的分子設計，仿生調控組織工程支架的生物、化學及力學信號，構建三維細胞外微環境，可實現組織工程支架對細胞粘附、增殖、遷移、分化及相關功能表達的誘導與調控[66]。

作者課題組通過基因工程手段，將人源E-cadherin與免疫球蛋白IgG1的Fc結構域融合構建了hE-cadherin-Fc融合蛋白，并探討了其對人骨髓間充質干細胞增殖及定向分化的影響。實驗結果表明[67]，材料表面hE-cadherin-Fc基質化后，通過與細胞表面E-cadherin形成同親性結合，顯著提高了hMSCs的粘附。與一般的細胞培養基質TC-PS平板及Gelatin涂膜平板相比(圖9，10)，在hE-cadherin-Fc改性平板表面培養hMSC細胞形態為長梭狀，更接近成纖維狀態，并在保持較高增殖速率的同時維持了良好的細胞未分化性。此外，在hE-cadherin-Fc平板表面進行hMSCs向肝細胞的定向誘導分化，所得肝樣細胞更多，CD117高表達，且肝樣細胞白蛋白分泌、尿素合成能力均高于對照組(圖11)。在后期實驗中，本課題組還嘗試將hE-cadherin-Fc融合蛋白用于PCL三維納米纖維支架的表面

圖9　聚苯乙烯培養板(PS)、組織培養處理培養板(TC-PS)、明膠涂膜(Gelatin)及hE-cadherin-Fc涂膜對間充質干細胞(MSC)增殖活性的影響(CCK-8法)(a)； TC-PS(曲線1)、Gelatin(曲線2)及hE-cadherin-Fc(曲線3)涂膜對MSC細胞CD105表達的影響(流式細胞分析)(b)[67]Fig.9　The proliferative activity of hMSCs on the PS-, TC-PS-, Gelatin- and hE-cadherin-Fc-coated surfaces(a); Flow cytometry analysis of undifferentiated state for hMSCs using the definitive undifferentiated state marker CD105. TC-PS(curve 1), gelatin-coated surface (curve 2)and hE-cadherin-Fc-coated surface(curve 3) (b) [67]

圖10　TC-PS(a)、Gelatin(b)及hE-cadherin-Fc(c)涂膜對MSC細胞形態的影響(細胞骨架蛋白熒光染色)[67]Fig.10　Morphological analysis of hMSCs cultured at 4, 24 and 48 h on TC-PS (a), gelatin-coated surface (b) and hE-cadherin-Fc-coated (c) surface .FITC-phalloidin labeled F-actin (gray) and PI nuclear staining (incanus) were used for immunofluorescence staining[67]

改性，發現該融合蛋白在納米纖維支架表面形成了穩定的Ca粘素單分子層，促進hMSCs粘附、增殖及成骨分化(圖12)[68]。上述結果表明：hE-cadherin-Fc融合蛋白改性組織工程支架可顯著改善hMSCs的體外增殖能力，并與相關細胞分化誘導因子和支架的物理結構特性協同調控hMSCs的定向分化，進一步顯示了基于Ca粘素融合蛋白的組織工程支架在再生醫學領域的應用前景。

圖11　hE-cadherin-Fc融合蛋白基質化平板上MSC細胞向肝細胞定向誘導分化圖：(a)CD117染色，(b)白蛋白分泌和(c)尿素分泌Fig.11　Hepatocyte-like cells differentiated from MSCs on hE-cadherin-Fc-coated plate： (a) CD117 staining，(b) albumin secretion,and (c) urea secretion

圖12　hE-cadherin-Fc修飾的取向/非取向電紡絲(左)及培養MSC細胞成骨分化潛能(右)的形貌：(a) rPCL, (b) E-rPCL,(c) aPCL,(d) E-aPCL[68]Fig.12　Morphology of hE-cadherin-Fc-coated nanofibrous scaffolds (left)and differentiation potential of hMSCs cultured on them(right):(a) rPCL,(b) E-rPCL,(c) aPCL, and (d) E-aPCL[68]

4結語

進入21世紀，生命科學發展日新月異，隨著國家綜合國力的增強，經濟的穩步提升，人們對個人生活質量越來越重視，特別是對健康問題尤為關注。我國生物材料在國家重點扶持之下，歷經了近40年的發展，取得了累累碩果，其中生物材料科學在整個生命科學中起到了舉重若輕的作用，為人們研究生命科學提供了一個全新的平臺與手段。

作為材料科學與生命科學的交叉學科，生物材料研究內容已逐漸涉及到醫學、生物學、工程學等諸多領域，并且從單一考察材料的化學、物理和力學加工性能逐步深入到植入材料對受體細胞和分子層面上的影響。通過基因重組技術，精確篩選具有特定分子量、氨基酸組成及序列、空間結構和功能的蛋白,連接融合形成具有多結構域的人工蛋白，并與高分子支架材料結合，仿生構建具有生物功能的新型復合人工細胞外基質的方法,逐漸展現出引人注目的應用前景。

參考文獻References

[1]Hench L L, Polak J M. Third-Generation Biomedical Materials [J].Science, 2002, 295(5 557): 1 014-1 017.

[2]Humes H D. Tissue Engineering of a Bioartificial Kidney: a Universal Donor Organ [J].TransplantProc, 1996, 28(4):2 032-2 035.

[3]Langer R, Vacanti J P. Tissue Engineering [J].Science, 1993, 260(5 110): 920-926.

[4]Mager M D, LaPointe V, Stevens M M. Exploring and Exploiting Chemistry at the Cell Surface [J].NatChem, 2011, 3(8):582-589.

[5]Goldberg M, Langer R, Jia X. Nanostructured Materials for Applications in Drug Delivery and Tissue Engineering [J].JBiomaterSciPolymEd, 2007, 18(3): 241-268.

[6]Meyer D E, Chilkoti A. Genetically Encoded Synthesis of Protein-Based Polymers with Precisely Specified Molecular Weight and Sequence by Recursive Directional Ligation: Examples from the Elastin-Like Polypeptide System [J].Biomacromolecules, 2002, 3(2):357-367.

[7]Gomes S, Leonor I B, Mano J F,etal. Natural and Genetically Engineered Proteins for Tissue Engineering [J].ProgPolymSci, 2012, 37(1):1-17.

[8]Anderson D G, Burdick J A, Langer R. Smart Biomaterials [J].Science. 2004, 305(5 692): 1 923-1 924.

[9]Lutolf M P, Hubbell J A. Synthetic Biomaterials as Instructive Extracellular Microenvironments for Morphogenesis in Tissue Engineering [J].NatBiotechnol， 2005, 23(1):47-55.

[10]Straley K,Heilshorn S. Designer Protein-Based Scaffolds for Neural Tissue Engineering [J].ConfProcIEEEEngMedBiolSoc， 2009:2 101-2 102.

[11]Sengupta D, Heilshorn S C. Protein-Engineered Biomaterials: Highly Tunable Tissue Engineering Scaffolds [J].TissueEngPartBRev， 2010, 16(3):285-293.

[12]Sandberg L B, Leslie J G, Leach C T,etal. Elastin Covalent Structure as Determined by Solid Phase Amino Acid Sequencing [J].PatholBiol(Paris), 1985, 33(4):266-274.

[13]Urry D W. Molecular Machines: How Motion and Other Functions of Living Organisms Can Result from Reversible Chemical Changes [J].AngewChemIntEdEng, 1993, 32(6):819-841.

[14]Gosline J M, DeMont M E, Denny M W. The Structure and Properties of Spider Silk [J].Endeavour, 1986, 10(1):37-43.

[15]Nagarsekar A, Crissman J, Crissman M,etal. Genetic Engineering of Stimuli-Sensitive Silkelastin-Like Protein Block Copolymers [J].Biomacromolecules, 2003, 4(3):602-607.

[16]Hayashi M, Tomita M, Yoshizato K. Production of EGF-Collagen Chimeric Protein which Shows the Mitogenic Activity [J].BiochimBiophysActa, 2001, 1 528(2-3):187-195.

[17]Ogiwara K, Nagaoka M, Cho C S,etal. Construction of a Novel Extracellular Matrix Using a New Genetically Engineered Epidermal Growth Factor Fused to IgG-Fc [J].BiotechnolLett, 2005, 27(20):1 633-1 637.

[18]Zhang J, Ding L, Zhao Y,etal.Collagen-Targeting Vascular Endothelial Growth Factor Improves Cardiac Performance after Myocardial Infarction [J].Circulation, 2009, 119(13):1 776-1 784.

[19]Sun W J, Sun C K, Zhao H,etal. Improvement of Sciatic Nerve Regeneration Using Laminin-Binding Human NGF-Beta [J].PLoSOne, 2009, 4(7):e6 180.

[20]Czajkowsky D M, Hu J, Shao Z,etal. Fc-Fusion Proteins: New Developments and Future Perspectives [J].EMBOMolMed. 2012, 4(10):1 015-1 028.

[21]Cherkupally P, Ramesh S, Torre B G. Immobilized Coupling Reagents: Synthesis of Amides/Peptides [J].ACSCombSci, 2014, 16(11):579-601.

[22]Cai L, Heilshorn S C. Designing ECM-mimetic Materials Using Protein Engineering [J].ActaBiomater, 2014, 10(4):1 751-1 760.

[23]Gustafsson C, Govindarajan S, Minshull J. Codon Bias and Heterologous Protein Expression [J].TrendsBiotechnol, 2004, 22(7):346-353.

[24]Welch M, Govindarajan S, Ness J E,etal. Design Parameters to Control Synthetic Gene Expression in Escherichia Coli [J].PLoSOne., 2009, 4(9):e7 002.

[25]Wurm F M. Production of Recombinant Protein Therapeutics in Cultivated Mammalian Cells [J].NatBiotechnol, 2004, 22(11):1 393-1 398.

[26]Adams J C, Watt F M. Regulation of the Development and Differentiation by Extracellular Matrix [J].Development, 1993, 117(4):1 183-1 198.

[27]Werner S, Grose R. Regulation of Wound Healing by Growth Factors and Cytokines [J].PhysiolRev, 2003, 83(3):835-870.

[28]Whitaker M J, Quirk R A, Howdle S M,etal. Growth Factor Release from Tissue Engineering Scaffolds [J].Pharm.Pharmacol, 2001, 53 (11): 1 427-1 437.

[29]Tada S, Kitajima T, Ito Y. Design and Synthesis of Binding Growth Factors [J].IntJMolSci, 2012,13(5):6 053-6 072.

[30]Cohen S. The Epidermal Growth Factor (EGF) [J].Cancer, 1983, 51(10):1 787-1 791.

[31]Yang X, Kessler E, Su L J,etal. Diphtheria Toxin-Epidermal Growth Factor Fusion Protein DAB389EGF for the Treatment of Bladder Cancer [J].ClinCancerRes, 2013, 19(1):148-157.

[32]Lan K L, Li J J, Tsai W C,etal. Biological Evaluation of 111In-DTPA-VEGF-EGF Fusion Protein in a Human Breast Cancer Cells Expressing EGFR/VEGFR [J].JNuclMed, 2012, 53(1):1 719.

[33]Squires C H, Childs J, Eisenberg S P,etal. Production and Characterization of Human Basic Fibroblast Growth Factor from Escherichia Coli [J].JBiolChem, 1988, 263(31):16 297-16 302.

[34]Hashi H, Hatai M, Kimizuka F,etal. Angiogenic Activity of a Fusion Protein of the Cell-Binding Domain of Fibronectin and Basic Fibroblast Growth Factor [J].CellStructFunct, 1994, 19(1):37-47.

[35]Saito W, Uchida K, Ueno M,etal. Acceleration of Bone Formation During Fracture Healing by Injectable Collagen Powder and Human Basic Fibroblast Growth Factor Containing a Collagen-Binding Domain from Clostridium Histolyticum Collagenase [J].JBiomedMaterResA, 2014, 102(9):3 049-3 055.

[36]Uchida K, Matsushita O, Naruse K,etal. Acceleration of Periosteal Bone Formation by Human Basic Fibroblast Growth Factor Containing a Collagen-Binding Domain from Clostridium Histolyticum Collagenase [J].JBiomedMaterResA, 2014, 102(6):1 737-1 743.

[37]Lesko E, Majka M. The Biological Role of HGF-MET Axis in Tumor Growth and Development of Metastasis [J].FrontBiosci, 2008, 13:1 271-1 280.

[38]Kitajima T, Terai H, Ito Y. A Fusion Protein of Hepatocyte Growth Factor for Immobilization to Collagen [J].Biomaterials, 2007, 28(11):1 989-1 997.

[39]Ohkawara N, Ueda H, Shinozaki S. Hepatocyte Growth Factor Fusion Protein Having Collagen-Binding Activity (CBD-HGF) Accelerates Re-endothelialization and Iintimal Hyperplasia in Balloon-Injured Rat Carotid Artery [J].JAtherosclerThromb，2007, 14(4):185-191

[40]Azuma K, Nagaoka M, Cho C S,etal. An Artificial Extracellular Matrix Created by Hepatocyte Growth Factor Fused to IgG-Fc [J].Biomaterials， 2010, 31(5):802-809.

[41]Kelinheinz J, Jung S, Wermker K,etal. Release Kinetics of VEGF165 from a Collagen Matrix and Structural Matrix Changes in a Circulation Model [J].HeadFaceMed, 2010, 19, 6:17.

[42]Yu M H, Du F Y, Hirohiko I,etal. Preparation and Characterization of a Fusion Protein Matrix VEGF-Fc for Enhancing HUVECs growth [J].BiotechnolLett, 2012, 34(9):1 765-1 771.

[43]Yu Meihua(于美華) , Du Fengyi(杜鳳移) , Rao Xia(饒霞),etal. 人工細胞外基質對血管內皮細胞生存的影響[J].ChemicalJournalofChineseUniversities(高等學校化學學報), 2013, 3: 746-750.

[44]Zhu C S, Xu J B, Yu M H,etal. The Immobilization of VEGF-Fc for Promoting Endothelial Cells Proliferation in Porous PCL Scaffolds. Advanced Materials Research [J].AdvancedMaterialsResearch, 2012, 554:1 721-1 724.

[45]Rosso F, Giordano A, Barbarisi M,etal. From Cell-ECM Interactions to Tissue Engineering [J].JCellPhysiol, 2004, 199(2); 174-180.

[46]Edelman G M, Crossin K L. Cell Adhesion Molecules: Implications for a Molecular Histology [J].AnnualReviewofBiochemistry, 1991, 60(1): 155-190.

[47]Punet X, Mauchauffé R, Giannotti M I,etal. Enhanced Cell-Material Interactions Through the Biofunctionalization of Polymeric Surfaces with Engineered Peptides [J].Biomacromolecules, 2013,14(8):2 690-2 702.

[48]Thiery J P, Engl W, Viasnoff V,etal. Biochemical and Biophysical Origins of Cadherin Selectivity and Adhesion Strength [J].CurrOpinCellBiol, 2012, 24(5):614-619.

[49]Nelson W J. Regulation of Cell-Cell Adhesion by the Cadherin-Catenin Complex [J].BiochemSocTrans, 2008, 36(Pt 2):149-155.

[51]Nagaoka M, Ise H, Akaike T. Immobilized E-Cadherin Model Can Enhance Cell Attachment and Differentiation of Primary Hepatocytes but not Proliferation [J].BiotechnologyLetters, 2002, 24(22):1 857-1 862.

[52]Drees F, Reilein A, Nelson W J. Cell-Adhesion Asays: Fabrication of an E-Cadherin Substratum and Isolation of Lateral and Basal Membrane Patches [J].MethodsMolBiol， 2005, 294:303-320.

[53]Vega L J C, Lee M K, Jeong J H,etal. Recapitulating Cell-Cell Adhesion Using N-Cadherin Biologically Tethered to Substrates [J].Biomacromolecules， 2014, 15(6):2 172-2 179.

[54]Kamiya K, Tsumoto K, Yoshimura T,etal. Cadherin-Integrated Liposomes with Potential Application in Adrug Delivery System [J].Biomaterials， 2011, 32(36):9 899-9 907.

[55]Behjati M, Kazemi M, Hashemi M,etal. Double-Chimera Protein to Enhance Recruitment of Endothelial Cells and Their Progenitor Cells [J].IntJCardiol， 2013, 167(4):1 560-1 569.

[56]Collazos-Castro J E, Hernández-Labrado G R, Polo J L,etal. N-cadherin and LI-functionalised Conducting Polymers for Synergistic Stimulation and Guidance of Neural Cell Growth [J].Biomaterials， 2013, 34(14):3 603-3 617.

[57]Place E S, Evans N D, Stevens M M. Complexity in Biomaterials for Tissue Engineering [J].NatureMaterials, 2009, 8：457-470.

[58]Bian L, Guvendiren M, Mauck R L,etal. Hydrogels that Mimic Developmentally Relevant Matrix and N-Cadherin Interactions Enhance MSC Chondrogenesis [J].ProcNatlAcadSci， 2013, 110(25):10 117-10 122.

[59]Zhang Y, Xiang Q, Dong S,etal. Fabrication and Characterization of a Recombinant Fibronectin/Cadherin Bio-inspired Ceramic Surface and Its Influence on Adherin and Ossification in Vitro [J].ActaBiomater, 2010, 6(3):776-785.

[60]Zhang Y, Li L, Zhu J,etal. In Vitro Obsevation of Self-assembled ECM-Mimetic Bioceramic Nanoreservoir Delivering rFN/CDH to Modulate Osteogenesis [J].Biomaterials， 2012, 33(30):7 468-7 477.

[61]Haque A, Hexig B, Meng Q,etal. The Effect of Recombinant E-Cadherin Substratum on the Differentiation of Endoderm-Derive Hepatocyte-Like Cells from Embryonic Stem Cells [J].Biomaterials， 2011, 32(8):2 032-2 042.

[62]Haque A, Yue X S, Motazedian A. Characterization and Neural Differentiation of Mouse Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells on the Cadherin-Based Substrata [J].Biomaterials, 2012, 33(20):5 094-5 106.

[63]Elnakish MT, Hassan F, Dakhlallah D,etal. Mesenchymal Stem Cells for Cardiac Regeneration: Translation to Bedside Reality[J].StemCellsInt, 2012: 646 038.

[64]Wagner W, Horn P, Castoldi M,etal. Replicative Senescence of Mesenchymal Stem Cells a Continuous and Organized Process [J].PLoSOne， 2008, 3(5):e2 213.

[65]Zangi L, Rivkin R, Kassis I,etal. High-Yield Isolation, Expansion, and Differentiation of Rat Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells with Fibrin Microbeads[J].TissueEng, 2006, 12(8):2 343-2 354.

[66]Zhong S, Zhang Y, Lim C T. Fabrication of Large Pores in Electrospun Nanofibrous Scaffolds for Cellular Infiltration: A Review [J].TissueEngPartBRev， 2012, 18(2):77-87.

[67]Xu J, Zhu C, Zhang Y,etal. hE-cadherin-Fc Fusion Protein Coated Surface Enhances the Adhesion and Proliferation of Human Mesenchymal Stem Cells [J].ColloidsSurfBBiointerfaces， 2013, 1(109):97-102.

[68]Xu J, Li S, Hu F,etal. Artificial Biomimicking Matrix Modifications of Nanofibrous Scaffolds by hE-Cadherin-Fc Fusion Protein to Promote Human Mesenchymal Stem Cells Adhesion and Proliferation [J].JNanosciNanotechnol， 2014, 14(6):4 007-4 013.

(編輯蓋少飛)

Recombinant Fusion Protein Based Biomaterialsfor Tissue Engineering

ZHANG Yan, XU Ke, GAO Chao, YANG Jun

(State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, College of Life Science, Nankai University,

Tianjin 300071, China)

Abstract：The construction of 3D biological substitutes consisting of cells and scaffolds is an expected approach for tissue repair and organ restoration. Normal biological activities of cells requires the continuous stimulation of signaling molecules from the extracellular microenvironment. As an important part of the artificial extracellular matrix, both chemical signals and physical forces of the biomaterials remodeling regulate cell gene and protein express but far not enough to extracorporealy re-sculpt tissue structure. Using gene and protein engineering technology, a fusion protein could be designed with multiple functions and improved the biological activities of natural or synthetic materials. In this article, we summarize the developments of biomaterials based on the fusion protein, as well as the concepts of fusion protein design and preparation. Meanwhile, we highlight the applications of fusion proteins that related to cell growth factors and cell adhesion factors in tissue engineering.

Key words：fusion protein; tissue engineering; extracellular matrix; extracellular microenvironment; vascularization; stem cells

中圖分類號：R318.08

文獻標識碼：A

文章編號：1674-3962(2015)03-0204-12

DOI:10.7502/j.issn.1674-3962.2015.03.03

通訊作者：楊軍，女，1968年生，教授，博士生導師，Email:yangjun106@nankai.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金資助項目(31370965 ); 科技部“973”計劃項目(2011CB606202 )

收稿日期：2014-11-18