回神顆粒對大鼠局灶性腦缺血再灌注腦損傷的保護機制研究*

回神顆粒對大鼠局灶性腦缺血再灌注腦損傷的保護機制研究*

摘要：目的：觀察回神顆粒對缺血性卒中腦海馬區不同時間點S100B蛋白表達的動態變化,研究回神顆粒對局灶性腦缺血再灌注損傷影響的可能機制。方法:取45只Wistar大鼠建立局灶性腦缺血再灌注(I/R)模型,隨機分成假手術對照組、腦I/R組、回神顆粒治療組,缺血2h后開始再灌注。免疫組化法檢測缺血不同時間各組腦海馬缺血中心和周圍區S100B蛋白,原位末端標記技術檢測各組腦海馬缺血中心和周圍區神經細胞凋亡。結果：腦I/R損傷組與假手術對照組比較，細胞凋亡數明顯增多(P<0.05), 回神顆粒治療組與腦I/R組相比,凋亡細胞數明顯減少(P<0.05);免疫組化檢測結果顯示, I/R組與假手術對照組相比, S100B蛋白表達明顯增加(P<0.05), 回神顆粒治療組與腦I/R組相比, S100B蛋白表達明顯減少(P<0.05)。結論：回神顆粒可能通過減少S100B蛋白表達、抗凋亡對局灶性腦缺血再灌注損傷(I/R)產生保護作用。

關鍵詞：回神顆粒；腦缺血；再灌注腦損傷；神經細胞；凋亡

前期臨床研究發現，回神顆粒在治療創傷性腦損傷、腦梗塞[1]、腦出血[2]、各種癡呆[3]等神經疾病方面都取得了良好的療效。實驗研究發現,回神顆粒對腦缺血再灌注損傷(I/R)具有神經保護作用[4]。S100B蛋白是神經膠質細胞分泌的蛋白質,是反映神經細胞損傷的標記物,目前國內外尚無給予回神顆粒治療腦缺血灌注區S100B蛋白動態觀察的相關報道。為進一步探討回神顆粒對缺血性腦損傷產生保護作用的機制,本文觀察了大鼠局灶性腦缺血再灌注后給予回神顆粒灌胃后對大鼠海馬區S100B蛋白表達的影響。

1材料與方法

1.1材料選用體重200～250g健康雄性Wistar大鼠45只，清潔級，合格證編號DK0501-0018，購自河北省實驗動物中心，在天津中醫藥大學動物實驗中心適應性飼養1周，隔日更換一次飼料及飲水。10%水合氯醛(沈陽試劑廠)，SABC試劑盒，原位細胞凋亡檢測試劑盒TUNEL(POD)(天津市灝洋生物制品科技責任有限公司提供)，DAB顯色劑(武漢博士德); 回神顆粒(天津中醫藥大學附屬武清中醫醫院);抗S100B抗體，尼龍線直徑2.3mm(日本伊東公司);BT-100恒流泵(上海滬西分析儀器廠)；全自動冰凍切片機(德國徠卡CM1850)；OLYMPUS HB-2顯微鏡(日本)，計算機圖像分析軟件(美國600CL Pixera)。

1.2實驗方法

1.2.1動物模型制備及分組缺血模型大鼠參照Zea-Longa線拴法復制大腦中動脈缺血模型(MCAO)。大鼠用10%水合氯醛(0.9mL/250g)麻醉，暴露出左側頸總動脈和分叉部，分離動脈分叉處的頸內動脈和頸外動脈，并分別穿線備用。將頸外動脈近心端結扎，將預先準備好的直徑為0.235mm、長約5cm、前端加熱成圓形的漁線栓子，用肝素浸泡后從剪口處插入，使漁線栓子經頸總動脈分叉部進入頸內動脈，向頭端深入至有阻力時，即阻斷大腦中動脈(MCA)入口處，結扎頸總動脈及剪口處，清潔縫合傷口。假手術對照組除不插入栓子外其余同實驗組。手術中和手術后維持動物體溫在37℃左右。缺血2h后,拔出栓子2mm,使血液再灌注。45只大鼠隨機分成I/R模型組、治療組、假手術組，各組再分成1d、3d、7d 3個亞組，每個亞組5只，分別于缺血后1d、3d、7d取腦組織。

1.2.2缺血各組處理方法均于術后當日起給藥。回神顆粒組給予回神顆粒灌胃。具體做法：用生理鹽水將回神顆粒稀釋成混懸液，按每人每日三次劑量5g×3=15g，則大鼠(體重200～250g)每日劑量為0.018g×15=0.27g，配成3mL灌胃液，每日一次性灌服治療，連續治療7d；假手術組和腦缺血模型(I/R)組僅給予3mL0.9%生理鹽水灌服。

1.2.3組織處理按不同缺血時間斷頭,取腦組織。實驗分3組:假手術組、 I/R組及回神顆粒治療組,每組15只,均為腦缺血2h再灌注1d、3d、7 d處死,每個時間點5只。

1.2.4免疫組化染色檢查各組大鼠至指定時間點處死后斷頭取腦,取前囟前后1mm腦組織,常規固定,石蠟包埋,每隔100μm連續冠狀切片(厚6μm),進行免疫組化染色檢測S100B蛋白的表達情況。顯微鏡下觀察海馬細胞胞漿有棕褐色顆粒者為陽性細胞。

1.2.5TUNEL原位凋亡染色法檢測細胞凋亡按照原位TUNEL試劑盒說明書對各組大鼠腦組織切片進行凋亡染色,細胞核中出現棕褐色顆粒者為陽性細胞。

2結果

2.1各組S100B蛋白表達腦I/R損傷組與假手術對照組相比, S100B蛋白表達明顯增加(P<0.01), 回神顆粒治療組較腦I/R組S100B蛋白表達明顯減少(P<0.05),見表1。

表1不同腦I/R時間點各組大鼠海馬

組別1d3d7dI/R模型組27.4±1.14*26.2±2.387*17.8±1.789*治療組22.4±1.949*#13.4±1.517*#11.2±1.581*#假手術組7.3±1.0926.9±1.1376.1±0.998

注：與假手術組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。

2.2神經細胞凋亡情況腦I/R組與假手術對照組比較，神經細胞凋亡數明顯增多(P<0.01), 回神顆粒治療組與腦I/R組比較，神經細胞凋亡數明顯減少(P<0.05),見表2。

　　　個

注：與模型組比較，*P<0.01，與假手術組比較，※P<0.05。

3討論

回神顆粒由全國名中醫專家、博士生導師、享受國務院特殊津貼專家,全國第三批名老中醫經驗繼承指導老師,首屆中醫藥傳承特別貢獻獎獲得者,中華中醫藥學會老年病分會副主任委員陳寶貴教授經過近50年的臨床及實驗研究研制而成,應用于臨床,對高血壓性腦出血急性期、創傷性顱腦損傷等療效顯著,可有效降低致殘率,提高生存質量[5]。

回神顆粒主要以鹿角、丹參、菖蒲、靈芝、郁金等藥物組成,該藥補益五臟精氣,兼以化郁、祛痰、消瘀,從而調整五臟功能,達到治療目的。現代藥理研究發現[6]，人參皂苷可以減少鈣沉積;石菖蒲水提醇沉液可以改善腦缺血缺氧狀態，促進學習記憶能力，抑制大鼠神經細胞凋亡[9];丹參酮具有鈣通道拮抗作用，減輕鈣超載;丹參、五味子、川芎嗪均可以對抗氧自由基引起的損傷[7]。該藥的前期動物實驗表明：回神顆粒可減少腦挫傷面積、細胞損傷、腦水腫程度，甚至還能恢復認知功能，改善空間記憶。作用機制目前有幾種理論：龐瑩等[4]認為，回神顆粒是通過上調BDNF的表達，起到控制腦缺血面積以及神經保護和修復的作用。趙廷浩等[8]發現，回神顆粒能改變Bcl/Bax基因表達的比率,使BclmRNA水平升高,BaxmRNA水平降低,產生抗細胞凋亡的作用。

本實驗顯示,對腦缺血再灌注損傷的大鼠使用回神顆粒治療后，可以明顯減少凋亡細胞數和S100B蛋白表達,說明回神顆粒能明顯減少I/R造成的神經細胞凋亡,提示局灶性腦缺血時給予回神顆粒治療，對神經元的保護作用可能與減少凋亡細胞的產生、S100B蛋白表達有關。這可能是回神顆粒治療各種腦損傷疾病、對腦缺血產生保護作用的機制之一。

參考文獻

[1]陳寶貴,趙振發,卞景芝,等.回神顆粒對實驗性大鼠局灶性腦缺血缺血區神經細胞凋亡的影響[J].天津中醫藥,2006,23(3)：227-230.

[2]陳慧媧,劉海東,陳寶貴.回神顆粒治療急性高血壓腦出血的療效觀察[J].天津中醫藥,2005,22(4)：330-330.

[3]崔俊波,陳慧媧,李洪艷,等.回神顆粒治療血管性癡呆臨床療效觀察[J].時珍國醫國藥,2007,18(9)：2 166-2 167.

[4]龐瑩,陳寶貴,楊卓.回神顆粒對大鼠急性腦梗死損傷中BDNF表達的影響[J].吉林中醫藥,2010,30(6)：535-537.

[5]劉海東,李傳勇,陳慧媧,等.回神顆粒治療重型顱腦創傷臨床療效觀察[A].《中醫腦病雜志》編輯部.中華中醫藥學會老年神經病專題學術研討會論文專輯[C].天津：《中醫腦病雜志》編輯部，2006：105-107.

[6]何艷芳，郭學芬，王軍.參麥對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的干預作用[J].現代中西醫結合雜志，2014，23(5)：475-479.

[7]鄒瓊，嚴明敏，查運紅，等.五味子乙素保護神經細胞作用及其可能機制[J].醫藥導報，2013，32(8)：1 010-1 012.

[8]趙廷浩,卞景芝,陳慧媧,等.回神顆粒對大鼠坐骨神經損傷后神經與骨骼肌組織形態學的影響[J].天津中醫藥,2006,23(4)：320-323.

[9]方永奇，吳啟瑞.石菖蒲對于缺血再灌注腦損傷大鼠神經細胞凋亡的影響[J].現代中西醫結合雜志，2002,11(17):1 647-1 649.

(收稿日期：2014-05-27)編輯：萬崇毅

*基金項目：國家中醫藥管理局全國名老中醫傳承工作室建設項目(國中醫藥人教發[2011]41號)。

中圖分類號：R285.5

文獻標識碼：A

作者簡介：★劉丹*劉丹(1981—)，女，博士。研究方向：心血管疾病。Tel：15122588780，E-mail：niki19860717@163.com。指導：陳寶貴(天津中醫藥大學附屬武清中醫醫院天津 301700)