他巴唑對甲狀腺濾泡細胞凋亡的影響

石　英　周秀文　李　浩　黃國良

1　福建省漳州市新浦醫院　363000；　2　福建醫科大學附屬漳州市醫院；　3　福建省協和醫院內分泌科

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他巴唑對甲狀腺濾泡細胞凋亡的影響

石英1周秀文2李浩2黃國良3

1福建省漳州市新浦醫院363000；2福建醫科大學附屬漳州市醫院；3福建省協和醫院內分泌科

他巴唑是抗甲狀腺藥物，屬于咪唑類化合物，適用于各種典型的甲狀腺亢進癥。經研究證明，基于甲狀腺濾泡上皮細胞的過度增生和肥大的原因而形成的甲狀腺腫伴隨著功能的格雷福斯病(GD)，是由于病理改變等原因，使得甲狀腺濾泡上皮細胞持續增生和自然凋亡減緩所造成的[1]。因此，對抗甲狀腺濾泡細胞的非正常增生和凋亡是治療甲狀腺功能亢進的重要途徑和方法。

1資料與方法

1.1臨床資料實驗所需的甲狀腺組織是屠宰場豬甲狀腺組織，把提取的10塊新鮮組織迅速進行組織分離和酶消化，然后送實驗室培養。所用試劑有胎牛血清、RPMI1640培養粉、磷酸鹽緩沖液(PBS)干粉、膠原酶、甲狀腺球蛋白克隆抗體等。所用醫療器械都是實驗室標準器械，符合醫療實驗標準。比如細胞培養板、超凈工作臺、倒置相差顯微鏡、雙重純水蒸餾器、FACScan型流式細胞儀、電泳儀(DYY-3 IC型)等。

1.2方法

1.2.1主要試劑的配置:上述實驗材料和實驗器械主要是為試劑的合成做更深一步的準備，比如用RPMI1640培養粉加碳酸氫鈉在pH值為7.2的情況下過濾、儲存、培養后加入青霉素、鏈霉素和胎牛血清等調和成RPMI1640培養液，為培養做準備；然后加入一定比例的胎牛血清，讓RPMI1640培養液中含胎牛血清10%;然后用KCl、NaCl、酚紅、去離子水等材料配置成D-Hanks液(HBSS)，然后低溫儲存備用；然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)干粉加去離子水配置成磷酸鹽緩沖液(PBS)；然后用胰蛋白酶加入磷酸鹽緩沖液(PBS)制成0.25%胰蛋白制劑備用；最后甲醇中放入Giesma(薩姆粉)加入甘油和磷酸鹽緩沖液(PBS)混合制成Giesma染色液[2]。

1.2.2培養和鑒別甲狀腺濾泡細胞(TFC):把取來的甲狀腺組織剪成小塊，一般是1~3mm，然后用以上準備的D-Hanks液(HBSS)漂洗，此時應注意去除其中的結締組織，同時漂洗時要充分洗去紅細胞等物質，以免影響實驗效果。然后在37℃的二型膠原酶的消化液中進行消化，30min收集1次細胞，一般收集4~5次即可。然后再把收集的離心過的細胞用D-Hanks液(HBSS)沖洗2~3次，最后將其放入含FSC的RPMI1640培養液中，提前準備好的恒溫箱內進行37℃培養4~5d，為了細胞很好的生長平均1~2d換1次培養液。甲狀腺濾泡細胞的檢測用SABC免疫組化試劑盒進行，一般是涂片后用丙酮固定，然后磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，大致3次，3min/次。清除氧化物酶后封閉PBS沖洗1次[3]。加入克隆抗體后再進行沖洗，此時再加入鏈霉卵白素，在37℃的情況下30min，再次PBS沖洗，最后用蘇木素復染即可。

2結果

2.1用Giesma染色后觀察甲狀腺濾泡細胞凋亡的影響。他巴唑的濃度依次設定為1×10-6、1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2，然后觀察可見，隨著濃度的增加，甲狀腺濾泡細胞的形態也在改變，詳見表1。

表1　他巴唑的濃度對甲狀腺濾泡細胞凋亡的影響(mol/L)

2.2同時對同種濃度的他巴唑分別在24h、48h、72h對甲狀腺濾泡細胞凋亡的情況進行觀察，發現其對甲狀腺濾泡細胞的凋亡也有影響，詳見表2。

表2　不同時間他巴唑對甲狀腺濾泡細胞凋亡的影響

2.3把他巴唑與結構相似的藥物比如：咪唑、硫脲進行對比試驗，發現咪唑、硫脲這類結構類似藥物對甲狀腺濾泡細胞凋亡情況的影響也有不同，詳見表3。

表3　他巴唑與類似結構藥物對甲狀腺濾泡細胞凋亡的影響

3討論

眾所周知的，細胞凋亡是細胞的程序性死亡，并且不帶炎癥等病理變化，是機體自我更新的必要形式。他巴唑自發現以來就是效果較好的抗甲亢藥物，實驗發現，他巴唑是通過抑制甲狀腺濾泡細胞的氧化酶系統來抑制碘化的[4]。患者在長期給藥的過程中，依附性較好，所以才得到廣泛的使用。甲狀腺功能亢進是由于甲狀腺濾泡細胞凋亡受到了某種抑制效果，使得甲狀腺濾泡細胞長期不斷地分化增生，從而患者的甲狀腺在功能和形態上發生了病理性變化。而在以上結果中筆者發現，當他巴唑的濃度為1×10-6時，對甲狀腺濾泡細胞幾乎沒有誘導其消亡的作用，但隨著濃度的改變，到1×10-3時，他巴唑對甲狀腺濾泡細胞誘導其消亡的作用最明顯。由此可見，他巴唑對甲狀腺濾泡細胞凋亡的影響是濃度越高，誘導其消亡的比率就越大，形態功能的變化越大；在不同時間的情況下，他巴唑對甲狀腺濾泡細胞的影響是時間越久對誘導甲狀腺濾泡細胞消亡的影響就越大，大致成正相關的關系；他巴唑中不僅含有硫脲基，還含有咪唑環。通過表3可以看出，咪唑對甲狀腺濾泡細胞的凋亡也有誘導作用。可以得出，他巴唑誘導甲狀腺濾泡細胞的凋亡不一定只是通過硫脲基，它還能通過現在未知的途徑對甲狀腺濾泡細胞的凋亡進行誘導。

從以上實驗對比可以看出，他巴唑對甲狀腺濾泡細胞的凋亡具有很好的誘導作用，濃度在1×10-3時效果最好，而時間則是72h內，誘導凋亡的作用隨著時間的增長呈正相關的關系。同時經過類似結構的藥物對比發現，他巴唑主要是通過硫脲基團的作用而對甲狀腺濾泡細胞的凋亡起誘導作用。

參考文獻

[1]何珂,胡蘊,毛曉明.淋巴細胞對人原代甲狀腺濾泡上皮細胞凋亡的影響〔J〕.免疫學雜志,2014,11(1):421-422.

[2]馬文竹.中醫藥對甲亢細胞凋亡影響的研究進展〔J〕.光明中醫,2014,6(20):63-64.

[3]連麗新.自噬對甲狀腺濾泡癌放化療增敏作用的研究〔D〕.長春：吉林大學,2014.

[4]劉純,張徽,等.凋亡相關蛋白Fas/FasL和BcL-2在自身免疫性甲狀腺病中的表達及意義〔J〕.內分泌外科,2002,1(1): 9-11.

(本文通訊作者：黃國良)

(編輯羽飛)

摘要目的：對他巴唑對甲狀腺濾泡細胞的影響進行深入探討和剖析，并對其作用的構效關系進行研究，以供相關工作人員借鑒。方法：用不同濃度的他巴唑對培養過的甲狀腺濾泡細胞(TFC)在不同作用時間進行比較，另外，用類似結構的藥物，比如硫脲、咪唑處理甲狀腺濾泡細胞,應用Annexin-V FITC/PI雙標染流式細胞儀對甲狀腺濾泡細胞凋亡率進行檢測，對比研究他巴唑對甲狀腺濾泡細胞凋亡的影響。結果：不同劑量的他巴唑對甲狀腺濾泡細胞凋亡的誘導有依賴性，甲狀腺濾泡細胞數量的明顯增多就是證明。類似藥物中的硫脲對甲狀腺濾泡細胞有相似的效果，但是咪唑對甲狀腺濾泡細胞沒有相關的效果。結論：他巴唑增多甲狀腺濾泡細胞的數量比率，主要是依賴硫脲基因產生誘導凋亡作用的。

關鍵詞他巴唑甲狀腺濾泡細胞凋亡研究影響 R9

文獻標識碼：A

文章編號：1001-7585(2015)15-1973-02

Tapazole Influence on Thyroid Follicular Cell Apoptosis

SHI Ying*，ZHOU Xiuwen，LI Hao，et al.*ZhangzhouSinpoHospital,ZhangzhouCity,FujianProvince363000

ABSTRACTObjective: Discuss and analyze the influences of tapazole on thyroid follicular cells (TFC) and study the structure-activity relationship of the influences,so as to provide a certain reference to the related personnel. Methods: Compare TFC cultured with tapazole of varied concentration at different time,treat TFC with drugs of the similar structure,including thiourea,imidazole,test the TFC apoptosis rate with the Annexin-V FITC/PI Dou S-P flow cytometer,and make a comparative research on the influences of tapazole on the TFC apotosis. Results: Tapazole of different dosages has induction and dependence on the TFC apotosis,which is justified by obvious increase of TFC. Thiourea in similar drugs has the similar effect on TFC,but imidazole has not the related effect on TFC. Conclusion: Topazole produces apoptosis effect of induced thyroid filtration cell by increasing the mumber rate of the thyroid filtration cells,aiming at the thioureido group.

KEY WORDSTapazole,Thyroid follicular cell apoptosis,The impact

收稿日期2015-04-10