首例同時(shí)攜帶blaNDM-1、blaKPC-2、blaDHA-1、blaTEM-1和blaOXA-1基因的ST11肺炎克雷伯菌臨床株

油麗萍，陳愛(ài)文，秦　萍，徐　茶，趙　輝，吳春梅，朱元祺*

(1．青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 青島266071；2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島266003)

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首例同時(shí)攜帶blaNDM-1、blaKPC-2、blaDHA-1、blaTEM-1和blaOXA-1基因的ST11肺炎克雷伯菌臨床株

油麗萍1，陳愛(ài)文2，秦萍2，徐茶1，趙輝1，吳春梅1，朱元祺2*

(1．青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 青島266071；2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島266003)

摘要：目的探討產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的耐藥機(jī)制，為醫(yī)院感染控制提供依據(jù)。方法法國(guó)VITEK-2 Compact對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)；改良Hodge試驗(yàn)初篩肺炎克雷伯菌是否產(chǎn)碳青霉烯酶；多重PCR對(duì)菌株進(jìn)行β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因和16S rRNA甲基化酶基因的檢測(cè)，測(cè)序確認(rèn)基因型；多位點(diǎn)序列分型和脈沖場(chǎng)凝膠電泳實(shí)驗(yàn)進(jìn)行細(xì)菌的同源性分析。結(jié)果5株肺炎克雷伯菌多位點(diǎn)序列分型是ST11型，其中4株都同時(shí)攜帶有blaspan、blaspan、blaspan和16S rRNA甲基化酶rmtB基因，另外1株(HD03)肺炎克雷伯菌同時(shí)攜帶blaspan、blaspan、blaspan、blaspan和blaspan基因。脈沖場(chǎng)凝膠電泳顯示，除了HD04菌株多一條帶外，其余帶型5株菌完全一致。結(jié)論經(jīng)檢索，肺炎克雷伯菌同時(shí)攜帶blaspan、blaspan、blaspan、blaspan和blaspan基因?yàn)閲?guó)內(nèi)外首次報(bào)道，且該感染者無(wú)國(guó)外流行病學(xué)史。因此，要進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥的腸桿菌的醫(yī)院感染控制和預(yù)防。

(ChinJLabDiagn,2015,19:0744)

碳青霉烯類(lèi)抗生素被認(rèn)為是目前臨床上治療革蘭氏陰性菌感染的最后的一道防線。隨著這類(lèi)抗菌素使用的增加，臨床上對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥的腸桿菌科細(xì)菌(carbapenem-resistant enterobacteriaceae，CRE)的分離率也不斷上升。在國(guó)內(nèi)外，由產(chǎn)KPC酶和/或金屬酶的腸桿菌科細(xì)菌造成的感染，甚至暴發(fā)流行，也均有報(bào)道[1-3]。尤其是產(chǎn)NDM-1金屬酶的“超級(jí)細(xì)菌”的出現(xiàn)，對(duì)臨床治療，控制醫(yī)院感染的流行和爆發(fā)，都將面臨更嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。因此，本研究是對(duì)2013年1-12月收集的碳青霉烯類(lèi)耐藥的5株肺炎克雷伯菌臨床株的耐藥表型、耐藥基因和同源性進(jìn)行檢測(cè)分析，以便為醫(yī)院感染控制提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1菌株的來(lái)源5株菌為2013年1月至2013年12月從臨床標(biāo)本中篩選出的對(duì)碳青霉烯耐藥的肺炎克雷伯菌。采用VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定和藥敏，判定耐藥性標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)CLSI2013(美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所制定)進(jìn)行，并以Escherichia coli ATCC25922，Escherichia coli ATCC35218和 Klebsiella pneumoniae ATCC700603作為質(zhì)控菌株。

1.2儀器和試劑法國(guó)VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)；北京天根生化科技有限公司的離心柱型，基因組提取試劑盒和電泳級(jí)瓊脂糖；大連寶生的PCR試劑盒和核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)；英國(guó)Oxoid公司的Mueller-Hinton培養(yǎng)基、美國(guó)Bio-Rad的PCR擴(kuò)增儀和脈沖場(chǎng)電泳，以及全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(Alpha Innotech)。

1.3耐藥基因的檢測(cè)按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行基因組提取。耐藥基因的PCR擴(kuò)增：(1)金屬酶和非金屬酶耐藥基因：KPC、BIC、OXA48、NDM、IMP、VIM、SPM、AIM、GIM、SIM、DIM)；(2)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因：SHV、TEM、OXA1、CTX-M分群；(3)AmpC基因：MOX、CIT、DHA、ACC、EBC；(4)16S rRNA甲基化酶基因。擴(kuò)增目的基因的引物及實(shí)驗(yàn)條件參照文獻(xiàn)[4-8]進(jìn)行。引物合成，陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，均由上海生工公司完成。獲得序列與GenBank中序列進(jìn)行比對(duì)，以確定基因型。

1.4多位點(diǎn)序列分型((multilocus sequence typing，MLST)和脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)依據(jù)MLST網(wǎng)站，設(shè)計(jì)7對(duì)管家基因的引物，PCR條件見(jiàn)網(wǎng)站。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行測(cè)序，序列結(jié)果在MLST網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)，以得到細(xì)菌的一個(gè)序列型。脈沖場(chǎng)凝膠電泳進(jìn)行同源性分析的操作參照相關(guān)文獻(xiàn)。電泳條件：設(shè)片段為10-400 kb，場(chǎng)強(qiáng)6 v，轉(zhuǎn)角120，電泳時(shí)間18 h。

2結(jié)果

2.1　菌株對(duì)常用抗生素的耐藥性和耐藥基因的檢測(cè)

分離的5株肺炎克雷伯菌對(duì)臨床常用的抗生素都耐藥，改良Hodge試驗(yàn)也均為陽(yáng)性。基因檢測(cè)顯示：5株菌中4株都同時(shí)攜帶有blaKPC-2、blaTEM-1、blaCTXG9和16S rRNA甲基化酶rmtB基因，另外1株(HD03)肺炎克雷伯菌同時(shí)攜帶blaNDM-1、blaKPC-2、blaDHA-1、blaTEM-1和blaOXA-1基因。結(jié)果詳見(jiàn)表1和圖1。

表1　產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷白桿菌分離株對(duì)常用抗生素耐藥性和攜帶的基因

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；1-5：HD01-05株blaKPC陽(yáng)性；3：HD03株blaNDM陽(yáng)性

圖1blaKPC和blaNDM基因多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2　菌株的同源性分析

5株肺炎克雷伯菌多位點(diǎn)序列分型都是ST11型。脈沖場(chǎng)凝膠電泳顯示，除了HD04菌株多一條帶外，5株菌其余帶型幾乎完全一致。結(jié)果詳見(jiàn)圖2。

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；1-5：HD01-HD05肺炎克雷伯菌臨床分離株

3討論

自2001年美國(guó)報(bào)道KPC酶后，世界各地均見(jiàn)報(bào)道，其中美國(guó)和希臘有顯著的地方性流行。2007年，Wei等首次報(bào)道[9]在國(guó)內(nèi)浙江地區(qū)發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)KPC-2酶的肺炎克雷伯菌，此后在全國(guó)各地陸續(xù)報(bào)道檢出KPC-2陽(yáng)性菌株。2009年，印度首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)產(chǎn)NDM-1酶的肺炎克雷伯菌。此后，世界多個(gè)國(guó)家和地區(qū)報(bào)道分離到產(chǎn)NDM-1酶的細(xì)菌。該酶可水解包括碳青霉烯類(lèi)在內(nèi)的幾乎所有廣譜β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，并可同時(shí)攜帶多種其他耐藥基因，給臨床治療和醫(yī)院感染控制帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。國(guó)內(nèi)感染攜帶產(chǎn)NDM-1酶基因細(xì)菌的病例數(shù)逐年增多，多為腸桿菌科細(xì)菌，且多屬散發(fā)，在浙江杭州、北京、上海、蘭州、江西和廣州等地均有報(bào)道。

多位點(diǎn)序列分型(sequence type，ST)是常用的分子流行病學(xué)研究方法。巴士德研究院2005年命名的ST11與2008年命名的ST258只有一個(gè)管家基因(tonB)的差別，屬于同一個(gè)克隆復(fù)合體CC258，兩者有比較近的親緣關(guān)系。研究表明，ST258型是歐美國(guó)家肺炎克雷伯菌KPC的主要流行株，中國(guó)則以ST11型為主。我們的結(jié)果表明，5株肺炎克雷伯菌都是ST11型，與國(guó)內(nèi)報(bào)道關(guān)于肺炎克雷白桿菌攜帶blaKPC-2基因的ST分型結(jié)果相似。但是，對(duì)于產(chǎn)NDM-1酶的肺炎克雷伯菌，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有主要的ST型流行株的相關(guān)報(bào)道。

分離的5株菌改良Hodge試驗(yàn)均為陽(yáng)性，且對(duì)常用的抗生素都耐藥。基因檢測(cè)顯示， 4株都同時(shí)攜帶有blaKPC-2、blaTEM-1、blaCTXG9和rmtB基因，但另外1株(HD03)肺炎克雷伯菌同時(shí)攜帶blaNDM-1、blaKPC-2、blaDHA-1、blaTEM-1和blaOXA-1基因。經(jīng)檢索，肺炎克雷伯菌同時(shí)攜帶blaNDM-1、blaKPC-2、blaDHA-1、blaTEM-1和blaOXA-1基因是國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道。對(duì)該菌攜帶質(zhì)粒的數(shù)目、大小、接合和轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)以及基因周?chē)h(huán)境的分析正在進(jìn)行。另外，脈沖場(chǎng)凝膠電泳顯示，除HD04菌株多一條帶外，5株菌其余帶型完全一致，根據(jù)Tenover制定的規(guī)則，提示醫(yī)院存在攜帶blaKPC-2肺炎克雷伯菌克隆株的流行。

綜上所述，本地肺炎克雷伯菌臨床株對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素的耐藥與其攜帶ESBLs基因、AmpC基因、碳青霉烯酶基因、以及其他耐藥基因的同時(shí)存在有關(guān)。提示我們，要加強(qiáng)耐藥菌的監(jiān)測(cè)，采取消毒隔離措施，防止CRE在醫(yī)院的擴(kuò)散和傳播。

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關(guān)鍵詞：肺炎克雷伯菌；基因；blaNDM-1；blaKPC-2；ST11

Coexistence ofblaNDM-1、blaKPC-2、blaDHA-1、blaTEM-1andblaOXA-1genes in a clinical ST11Klebsiellapneumoniaeisolate in chinaYOULi-ping,CHENAi-wen,QINPing,etal.(TheMedicalCollegeofQingdaoUniversity,Qingdao266071,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the molecular mechanism of the clinical carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniaeisolates.MethodsThe strains identification and antibiotic susceptibilities were performed by VITEK-2 compact system.The genes of AmpC，ESBLs，MBL and KPC β-lactamases were screened by specific PCR.And genotypes were confirmed by DNA sequencing.PFGE and multilocus sequence typing (MLST) were performed.Results5Klebsiellapneumoniaeisolates were resistant to all antibiotics tested.Genotyping(PFGE) clustered 5K.pneumoniaeisolates into a single clonal type and MLST assigned them to sequence type 11.Theblaspan，baspan，blaspanand rmtB genes were present in four isolates.And Molecular testing verified the presence ofblaspan，blaspan，blaspan，blaspanandblaspangenes in aKlebsiellapneumoniaeisolate.ConclusionTo our knowledge,this is first report of coexistence ofblaspan，blaspan，blaspan，blaspanandblaspangenes in a clinicalKlebsiellapneumoniaisolate.It may herald the emergence of a new pattern of drug resistance.Surveillance of metallo-β-lactamases inenterobacteriaceaeis urgently needed to control and prevent the spread of these isolates.

Key words:Klebsiellapneumonia;Gene;blaNDM-1;blaKPC-2;ST11

(收稿日期：2014-05-07)

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類(lèi)號(hào)：R378

文章編號(hào)：1007-4287(2015)05-0744-04

*通訊作者

基金項(xiàng)目：青島經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)重點(diǎn)科技發(fā)展項(xiàng)目(2013-1-82)