短串聯重復序列連鎖分析進行產前診斷前母血污染鑒定的研究

張清健，鄭立新，田佩玲，葉嘉玲，楊　衛，王柏賢，徐珊珊，周冰燚，蔡慧娜，方俊宇，朱志勇

(廣東省計劃生育科學技術研究所 生殖科，廣東 廣州510600)

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短串聯重復序列連鎖分析進行產前診斷前母血污染鑒定的研究

張清健*，鄭立新，田佩玲，葉嘉玲，楊衛，王柏賢，徐珊珊，周冰燚，蔡慧娜，方俊宇，朱志勇

(廣東省計劃生育科學技術研究所 生殖科，廣東 廣州510600)

摘要：目的建立一種簡單易行，快速，準確的母血污染鑒定技術，應用于產前診斷前排除母血污染。方法在X染色體上選取具有高雜合度和高多態性的6個短串聯重復序列位點，應用連鎖分析對10例羊水和10例臍帶血標本進行母血污染鑒定。結果在10例羊水和10例臍帶血標本中各發現1例標本發生母血污染。結論該方法可應用于臨床實驗室進行產前診斷前排除母血污染。

(ChinJLabDiagn,2015,19:0728)

臨床上，用于遺傳病產前診斷的羊水和臍帶血標本，有時會在穿刺過程中受到母血的污染，可能產生錯誤的產前診斷結果而引起醫療糾紛。我們在X染色體上選取具有高雜合度和高多態性的6個位點(見表1)作為個體識別標志,采用多重PCR結合銀染檢測技術檢測產前診斷前羊水和臍血是否存在母血污染，旨在建立一種簡單易行、快速、準確的母血污染鑒定方法，現報告如下。

1材料與方法

1.1　對象

20例個體均遵照知情同意原則，采集其靜脈血和羊水或臍帶血標本。

1.2　方法

1.2.1雙盲法處理標本收集標本的人員，用母血人為污染若干例羊水或臍血標本；而實驗檢測和分析人員并不知情。

1.2.2外周血、羊水細胞和臍血DNA的提取采用常規苯酚抽提法提取外周血DNA。

1.2.3PCR擴增在95℃3 min，95℃ 40 s，于相應的Tm進行退火35 s，72℃延伸35 s(時間可根據片段大小進行調整，具體引物序列及Tm值見表2)，30-33個循環，72℃總延伸8 min，4℃保存。變性聚丙烯酰胺凝膠電脈，銀染法檢測。

表1　6個微衛星位點詳細情況

注：雜合度：表示在人群中，該等位基因位點為雜合的概率。雜合度高的位點有利于單體型分析，信息含量高。

表2　6個位點引物序列

2結果

2.1在10例臍血之母血污染檢測圖1所示3號臍血標本，從44CA、45CA和63CA明顯可排出母血污染。圖2所示6號發生污染，其余9例未發現母血污染，與預期結果相符。

圖1　3號臍血標本檢測結果，從44CA、45CA和63CA明顯可排出母血污染

圖2　從6個位點上可判斷6號臍血標本發生了母血污染

2.2在10例羊水之母血污染檢測10號發現存在母血污染，其余9例未發現母血污染；與預期結果相符(圖3、圖4)。

圖3　9號羊水標本檢測結果，從44CA、45 CA和49 CA可明顯排除母血污染

圖4　從6個位點上可判斷10號羊水標本發生了母血污染

3討論

Kleihaure抗酸染色法是鑒別母血與胎血的傳統技術。此技術原理是有核紅細胞中胎兒血紅蛋白與成人血紅蛋白之間結構上的差異導致胎兒血紅蛋白比成人血紅蛋白更能抵抗酸變性[1]。Kleihaure抗酸染色法廣泛應用于母嬰溶血、妊娠期間外傷及陰道出血等臨床檢測。其優點是操作簡單，成本低廉；缺點是如果母體血液中HBF含量的異常升高(如鐮狀細胞病或部分β地中海貧血病)，染色過程中就會出現將母血誤為胎兒血的錯誤結果。例如，在18例用Kleihaure抗酸染色技術鑒定實驗中，Holcomb WL[2]等發現至少有2例將母血錯誤地鑒定為胎兒血。

流式細胞術是70年代初發展起來的一項高新技術，其工作原理是采用激光作為激發光源，保證其具有更好的單色性與激發效率；利用熒光染料與單克隆抗體技術結合的標記技術，保證檢測的靈敏度和特異性；用計算機系統對流動的單細胞懸液中單個細胞的多個參數信號進行數據處理分析，保證了檢測速度與統計分析精確性。流式細胞儀比Kleihaure抗酸染色法快速、靈敏和特異[3]；缺點是儀器價格昂貴，還要制備各種昂貴的抗體進行熒光染色，操作過程繁瑣且技術要求高，因而難以普及。

短串聯重復序列(short tandem repeat,STR)位點是人類基因組DNA中廣泛存在的一類具有高度多態性和遺傳穩定性的遺傳標記。它是由2-6個堿基對組成的核心序列,經過幾次到幾十次串聯重復,構成特定的DNA片段遺傳標記，每個個體同一等位基因上這種系列重復次數不同，呈多態性并按孟德爾規律呈共顯性遺傳[4]。

在短串聯重復序列中，小的變異幾乎潛伏著無限等位基因的變異，鑒定這些變異，甚至在單個座位的基因型足可以鑒定一個個體，如有4個以上位點不排斥假設父親時，一般父親關系概率均在99.7%以上[5]，因而選取幾個位點可作為一有效個體識別標志，具有極強的特異性；另外結合PCR技術，使得此技術具有極強的靈敏度，理論上羊水或臍帶血標本只要含有一個母體有核細胞，就可以得到鑒別。我們選取具有高雜合度和高多態性的6個STR位點,應用多重PCR結合銀染對10例羊水和10例臍血標本進行母血污染鑒定，結果與預期一致，準確可靠。此技術還具有操作簡單，所需設備簡便，成本低廉的優點。適宜在普通醫院進行推廣，具有廣闊的應用前景。

參考文獻：

[1]Martel-Petit V,Petit C,Marchang M.Use of the Kleihaure test to detect fetal erythroblasts in the maternal circulation[J].Prenat Diagn,2001,21(2):106.

[2]Holcomb WL，Gunderson E,Petrie RH.Clinical use of the Kleihaure-Betke test[J].Perinat Med,1990,18(5):331.

[3]Fernandes BJ,von Dadelszen P,Fazal,et al.Flow cytometric assessment of feto-maternal hemorrhage;a comparison with Betke-Kleihaure[J].Prenat Diagn,2007,27(7):641.

[4]Edwards AL,Civitello A.DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats[J].Am J Hum Genet,1991,49(4):746.

[5]周新,孫連名,吳健民，等.檢驗醫學考核指南[M].第2版.武漢:湖北科學技術出版社，2004:386.

關鍵詞：連鎖分析；產前診斷；母血污染

Identification of maternal blood contamination before prenatal diagnosis with short tandem repeat sequences linkage analysisZHANGQing-jian,ZHENGLi-xin,TIANPei-ling,etal.(FamilyPlanningResearchInstituteofGuangDongProvince,Guangzhou510600，China)

Abstract:ObjectiveTo establish a simple,rapid,accurate maternal blood contamination identification technology,used to exclude maternal blood contamination before prenatal diagnosis.Methods6 short tandem repeat loci on the X chromosome with high heterozygosity and polymorphism were selected to identify maternal blood contamination from 10 cases of amniotic fluid and 10 cases of umbilical cord blood specimens by linkageanalysis.ResultsIn 20 cases of samples,one case of amniotic fluid and one case of umbilical cord blood samples occurred in maternal blood contamination,respectively.And the experiment results agree with expected results.ConclusionThis method can be used to exclude maternal blood contamination before prenatal diagnosis in clinical laboratories.

Key words:linkage analysis;prenatal diagnosis;maternal blood contamination

(收稿日期：2014-12-16)

作者簡介：張清健(1977-)，男，副主任技師，碩士，研究方向：生殖遺傳學。

文獻標識碼：A

中圖分類號：R714

文章編號：1007-4287(2015)05-0728-04

*通訊作者

基金項目：廣東省計生委項目(編號：2009202)