穿心蓮內酯對體外視網膜母細胞瘤細胞增殖與凋亡的影響

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穿心蓮內酯對體外視網膜母細胞瘤細胞增殖與凋亡的影響

辛浩蓉1,閆東君2*,王旭飛1

(1.吉林省人民醫院 眼科， 吉林 長春130021;2.吉林大學中日聯誼醫院 眼科，吉林 長春130033)

視網膜母細胞瘤(retinoblastoma,RB)是嬰幼兒期最常見的眼內惡性腫瘤， 嚴重損害患兒的視力，并對生命健康產生威脅[1]。臨床工作中，常用的眼球摘除、外放射治療、化學治療對于患兒的心理和身體狀態的考驗、損傷都是比較大的 。細胞增生增加是所有腫瘤失控性生長的主要分子生物學機制之一[2]，因此，探索抑制RB細胞增殖活性、毒副作用較小的藥物，對眼內惡性腫瘤的治療具有重要意義。

近年來歷史悠久的中藥在多種抗腫瘤藥物中占據了較為突出的優勢，沒有明顯的毒副作用是眾多化學治療藥物所不能及的。穿心蓮內酯(Andrographolide， AD)是傳統中草藥爵床科植物穿心蓮中提取出來的一類二萜類化合物,它通常作為一種消炎解毒藥物用于治療各種感染性疾病[3]。現代藥理活性研究表明，AD除了傳統的抗病毒作用外，也具有抗腫瘤的潛能[4，5]。目前，已經有將穿心蓮內酯作為有效成份的滴眼液用于眼部炎癥的臨床治療，但是穿心蓮內酯對眼內腫瘤RB有何影響，尚不清楚。本研究旨在觀察AD 對人視網膜母細胞瘤 HXO-Rb44細胞的增殖和凋亡的何影響。

1材料與方法

1.1藥品和細胞株穿心蓮內酯(純度>98%)購自Sigma- Aldrich 化學制品公司，用RPMI-1640培養液溶解，配制成 100 μg/ml的溶液濾過除菌保存備用。人RB細胞株HXO-Rb44，購自中南大學湘雅醫學院腫瘤研究所。

1.2主要試劑和儀器RPMI-1640(美國Hyclone公司)，類標準胎牛血清(中美合資蘭州民海生物工程有限公司)，噻唑藍 (美國Sigma公司)，異硫氰酸熒光素標記的膜聯蛋白V(AnnexinV-FITC)/碘化丙啶(propidium iodine，PI)雙染試劑盒(美國Sigma公司)。二氧化碳恒溫培養箱(德國Heraeus公司)，低溫細胞涂片離心機，流式細胞儀(美國Becton Dikinson公司)。

1.3細胞培養人視網膜母細胞瘤系 HXO-Rb44采用10%胎牛血清，青、鏈霉素各100 U/ml，RPMI-1640培養液，在37℃、5%CO2孵箱內培養，每3天更換培養基或進行細胞傳代培養。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態和生長狀態，細胞懸浮狀態生長，選取對數生長期細胞用于實驗。

1.4噻唑藍比色法(MTT)測定細胞增殖收集對數生長期HXO-Rb44細胞，制備成密度為5×105/ml細胞懸液，接種到96孔板，80 μl/孔，根據相關文獻結合預實驗結果，在96孔板中分別加入不同濃度的AD液20 μl/孔，使終濃度分別為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μg/ml， 另一組加入RPMI-1640培養液20 μl作為空白對照組。每個濃度加6個孔，共同置于37℃、5%CO2孵箱內培養24 h后，加入MTT液作用4 h，再加入酸化的10%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶解12 h，采用酶標儀在570 nm波長處測定吸光度(A)值，計算出穿心蓮內酯對HXO-Rb44細胞的增殖抑制率及藥物的半數抑制濃度(IC50)。

1.5流式細胞儀測定細胞凋亡率收集對數生長期細胞，制備成密度為5×105/ml，接種到100 ml培養瓶中，根據增長抑制率在50%以下的原則，選用IC50為30 μg/ml穿心蓮內酯作為最佳實驗藥物濃度，對照組采用RPMI-1640替代AD，37℃孵箱內分別培養24 h、48 h后，離心收集，加入預冷的PBS洗滌。各取1 ml細胞， 依次加入10 μl AnnexinV-FITC和5 μl PI，混勻，避光并在室溫下反應20 min，流式細胞儀檢測，以隨機Cell Quest分析軟件結果計算細胞凋亡率。

2結果

2.1　穿心蓮內酯對HXO-Rb44細胞增殖活性的影響

2.5-80.0μg/ml濃度范圍的AD對體外培養的HXO-Rb44細胞作用24h后，經過MTT檢測，統計分析結果，不同濃度AD實驗組的A值分別與對照組比較，差異具有統計學意義(P<0.01)。計算出HXO-Rb44細胞增殖抑制率，實驗結果(如圖1)顯示AD對HXO-Rb44細胞有明顯的增殖抑制作用，并且隨著AD濃度的增大，抑制作用逐漸增強，呈現一定的劑量依賴性。AD對HXO-Rb44細胞的IC50為(16.003±0.015μg)/ml。

圖1　AD作用HXO-Rb44細胞后24h增殖抑制率

2.2　穿心蓮內酯對HXO-Rb44細胞凋亡率的影響

根據MTT實驗結果，增長抑制率在50%以下的原則，選用IC50為30μg/ml穿心蓮內酯作為最佳實驗藥物濃度。16μg/mlAD分別作用HXO-Rb44細胞24h、48h后AnnexinV/PI雙染流式細胞法檢測細胞的凋亡率的變化，正常活細胞AnnexinV及PI均低染(AnnexinV-PI- ) ,分布在流式細胞分析圖的左下區(LL) ；早期凋亡細胞AnnexinV高染而PI低染(AnnexinV+PI- ) ,分布在圖的右下區(RL)；晚期凋亡及死亡細胞AnnexinV及PI均高染(AnnexinV+PI+ ) ,分布在圖的右上區(RU)。將早期凋亡細胞百分數(RL)和晚期凋亡細胞百分數(RU)之和稱為總凋亡率。結果(見圖2)顯示未經藥物作用的對照組HXO-Rb44細胞的凋亡率僅為(1.61±0.09)%，AD作用24h后細胞凋亡率增加至(17.45±1.10)%，與對照組相比顯著升高(P<0.01)。隨著AD作用時間延長到48h，HXO-Rb44細胞的凋亡率逐步增加至(41.07±2.66)%。

A．正常對照組　B.AD作用24h組　C.AD作用48h組

3討論

在我國視網膜母細胞瘤發病率居眼內惡性腫瘤之首，最常見于嬰幼兒時期，患兒的早期就診率較低，早已經不適宜保守治療，常常需要眼球摘除術、化學治療或外放射治療以挽救生命，這種破壞性較大的治療方法對患兒的心理和生存質量都是巨大的考驗。傳統的治療模式已經無法滿足人們提高生存質量的需求，價格昂貴的放化療同時帶來的各種嚴重副作用和抗藥性也限制了臨床應用。因此，尋求新的治療渠道和治療藥物成了近來研究熱點。本實驗通過體外觀察中藥穿心蓮內酯對HXO-Rb44細胞的影響，為治療視網膜母細胞瘤尋求新的藥物。

穿心蓮內酯(andrographolide,AD)是天然中藥植物穿心蓮的主要有效成分，為穿心蓮二萜內酯類化合物主要成分之一，具有免疫調節、清熱解毒、消炎利膽等作用。近年來，隨著現代藥理研究的多樣化發展，穿心蓮內酯在抗腫瘤方面具有良好的生物活性，為臨床應用提供了理論依據。本實驗發現，AD可抑制HXO-Rb44細胞的增殖，且在一定范圍內呈劑量依賴性，表明AD有作為藥物治療RB的潛能。

MTT法是一種經典的檢測細胞增生活性的方法，已廣泛用于抗腫瘤藥物篩選，具有靈敏度高、 重復性好、 操作簡單的特點。本實驗中采用MTT法對AD抑制人HXO-Rb44細胞增殖的作用進行了測定，并計算出2.5-80.0μg/mlAD對HXO-Rb44細胞的抑制率和IC50，發現AD能夠明顯的抑制HXO-Rb44細胞的增殖，治療效價較好，隨著藥物濃度的增加，抑制率也逐漸的增加，具有一定的劑量依賴性。此外，作為反應藥物對腫瘤細胞敏感性的指標IC50也提示AD對HXO-Rb44細胞的敏感性較高。

腫瘤的發生發展與諸多因素相關，如細胞增殖的增強、凋亡的抑制、新生血管形成等方面，增生與凋亡的平衡失調是腫瘤細胞的生物學特性之一。因此我們檢測了AD作用后HXO-Rb44細胞的凋亡率。細胞凋亡，即程序性細胞死亡,在許多生理和病理調節過程中發揮著重要作用,其定性和定量檢測對于基礎和臨床用藥研究都有指導意義。本實驗中經過AnnexinV/PI雙染后流式細胞儀檢測，AD作用24h后的HXO-Rb44細胞凋亡率從對照組1.61%增加至17.45%，隨著時間延長，細胞凋亡率繼續增加，呈現一定的時間效應。

綜合上述，本實驗研究結果顯示AD能夠抑制HXO-Rb44細胞增殖，并且促進細胞凋亡，為AD加入RB的綜合治療提供了一定的發展依據，但其具體的調控靶點和相關作用機制還有待進一步深入研究。

參考文獻：

[1]李鳳鳴,主編.眼科全書[M].北京：人民衛生出版社,1996：2382-2390.

[2]ZhouBB,ElledgeSJ.TheDNAdamageresronse：puttingcheckpointsinperspective[J].Nature,2000,408：433.

[3]LeeJC,TsengCK,YoungKC,etal.Andrographolideexertsanti-hepatitisCvirusactivitybyup-regulatinghaemeoxygenase-1viathep38MAPK/Nrf2pathwayinhumanhepatomacells[J].BrJPharmacol,2014,171(1)：237.

[4]LinHH,TsaiCW,ChouFP,etal.Andrographolidedown-regulateshypoxia-induciblefactor-1alphainhumannon-smallcelllungcancerA549cells[J].ToxicolApplPharmacol,2011,250(3)：336.

[5]KuttanG,PratheeshkumarP,ManuKA,etal.Inhibitionoftumorprogressionbynaturallyoccurringterpenoids[J].PharmBiol,2011,49(10)：995.

(收稿日期：2014-06-09)

文章編號：1007-4287(2015)05-0716-03

*通訊作者

基金項目:吉林省衛生計生委科研課題(2014ZC024)