β-catenin蛋白在紫杉醇治療宮頸癌中表達的研究

黃彤輝

南華大學附屬南華醫院婦產科，湖南省衡陽市　421002

β-catenin蛋白在紫杉醇治療宮頸癌中表達的研究

黃彤輝

南華大學附屬南華醫院婦產科，湖南省衡陽市421002

摘要目的：本研究通過檢測β-catenin蛋白在紫杉醇治療宮頸癌過程中的表達, 探討wnt/β-catenin信號通路在紫杉醇治療宮頸癌中的作用機制。方法：MTT 比色法檢測不同濃度紫杉醇對人宮頸癌Caski細胞株增殖的影響，計算抑制率及IC50，對照組未予紫杉醇處理，而實驗組則加入紫杉醇(IC50終濃度)，采用細胞免疫組織化學法檢測兩組Caski細胞β-catenin 蛋白表達。結果：采用不同紫杉醇溶液濃度分別作用Caski細胞24h、48h及72h后，通過MTT比色法檢測結果顯示對細胞的抑制作用隨藥物濃度的增加而增強，IC50值由IC50專用計算軟件求得IC50=(6.04±1.70)nmol/L。實驗組和對照組β-catenin蛋白于胞漿胞核中均有表達，實驗組β-catenin蛋白表達陽性率為39.3%，對照組β-catenin蛋白表達陽性率為71.7%，實驗組中陽性率明顯減少(P<0.05)。紫杉醇對Caski細胞增殖的影響呈劑量效應和時間效應關系。實驗組β-catenin蛋白表達陽性率為39.3%，對照組β-catenin蛋白表達陽性率為71.7%，實驗組中陽性率明顯減少(P<0.05)。結論：單純應用一定濃度的紫杉醇均能抑制Caski細胞的增殖。紫杉醇能夠抑制宮頸癌Caski細胞內β-catenin 蛋白表達，呈濃度依賴性，從而阻斷wnt/β-catenin信號傳導通路，同時影響癌基因表達，進而誘導宮頸癌Caski細胞的凋亡。

關鍵詞紫杉醇β-catenin蛋白wnt/β-catenin信號通路

The Study on Expression of β-catenin Protein after Paclitaxel on Cervical Cancer

HUANG Tonghui.AffiliatedNanhuaHospital,UniversityofSouthChina,HengyangCity，Hu’nanProvince421002

ABSTRACT Objective:In this study, the core protein expression changes of wnt/β-catenin signaling pathway detected from protein levels after paclitaxel on Caski cells, and then exploring the mechanism of the wnt/β-catenin signaling pathway in the course of paclitaxel treatment of cervical cancer.Methods:To detect with different density of paclitaxel on the proliferation of human cervical carcinoma Caski cell by MTT colorimetric assay. Calculated inhibition ratio and IC50.Experimental group added paclitaxel. Control group were not treated incubator.β-catenin protein expression were detected by immunohistochemistry.Results:The inhibitory effect on the cell increase while the drug concentration increased. In experimental group, the positive rate was 39.3%. In control group, the positive rate was 71.7%. The positive rate in experimental group was significantly decreased (P<0.05).Conclusion:The effect of Paclitaxel inhibiting Caski cell is exact. Application of a certain concentration of paclitaxel merely can inhibit the proliferation of Caski cells. Paclitaxel can inhibit the expression of β-catenin protein in cervical cancer Caski cells,thereby blocking the wnt/ β -catenin signal transduction pathway, and inducing apoptosis of cervical cancer Caski cell.

KEY WORDS Paclitaxel,β-catenin, wnt/β-catenin signaling pathway

1材料與方法

1.1宮頸癌細胞株的建立人宮頸癌Caski細胞株由南華大學生物學研究所實驗室傳代保存。用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養基培養人宮頸癌Caski細胞，取80%~90%對數生長期且生長至鋪滿培養瓶的細胞用于實驗。

1.2MTT比色法檢測不同濃度紫杉醇對人宮頸癌Caski細胞株增殖的影響細胞貼壁約2h后加入不同濃度紫杉醇溶液各100μl，各實驗組紫杉醇溶液的濃度分別為0.001μg/ml、0.010μg/ml、0.100μg/ml、1.000μg/ml、10.000μg/ml、100.000μg/ml、1 000.000μg/ml。每種濃度設5個復孔。對照組為新鮮培養液(含 10%的胎牛血清)。每孔加入0.5%噻唑藍溶液20μl，繼續培養約4h。加入含胎牛血清的新鮮培養基終止培養， 每孔加入250μl二甲基亞砜溶液，測量各孔的吸光值(OD)：計數抑制率及IC50值；以空白調零計算細胞增殖抑制率(%)=[1- (實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%；IC50值由IC50專用計算軟件求得。所有實驗重復3次，每組至少設置5個副孔。

1.3細胞免疫組化法觀察β-catenin蛋白在人宮頸癌Caski細胞中的表達滴加正常山羊血清工作液1~2 滴(將細胞覆蓋完)，37℃孵育 30min， 滴加一抗(兔抗人β-catenin 單克隆抗體25μg/ml)置 4℃冰箱孵化過夜，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照，置4℃冰箱過夜。 生物素標記二抗，滴加過氧化物酶(辣根過氧化物酶)約 2 滴，37℃溫箱中孵育 15min，DAB 顯色， 蘇木素復染1min，封片，置鏡下觀察。

1.4顯微鏡下圖像判斷標準觀察染色結果：以在胞漿、細胞核和(或)胞膜內出現棕褐色細小顆粒為本實驗中β-catenin蛋白的陽性表達。高倍鏡(×400)下根據細胞的染色強度和陽性細胞的計數進行半定量分析。評分標準如下：A染色強度：3分為黃褐色，2分為棕黃色，1分為淡黃色，0分為不著色；B計數標準：以序列方式隨機選取20個高倍視野(×400)，每個視野中(從左至右，從上至下)計數100個完整的腫瘤細胞。判定標準：按照著色細胞的百分率記分，分為0~4分(其中0分為<5%， 1分為5%~25%， 2分為26%~50%， 3分為50%~75%， 4分為>75%)。

2結果

2.1不同濃度紫杉醇對宮頸癌Caski細胞株增殖的影響本實驗采用不同濃度紫杉醇溶液分別作用Caski細胞24h、48h及72h后，通過MTT比色法檢測結果顯示，對細胞的抑制作用隨藥物濃度的增加而增強，隨藥物作用的時間延長而增強。單純應用某一濃度的紫杉醇均能抑制Caski細胞的增殖，其對增殖的影響呈劑量效應和時間效應關系。IC50=(6.04±1.70)nmol/L。見圖1和表1。

不同濃度紫杉醇(μg/ml)

圖1不同濃度紫杉醇對宮頸癌Caski細胞增殖的影響

2.2紫杉醇對β-catenin蛋白在Caski細胞中表達的影響實驗組和對照組β-catenin蛋白于胞漿、細胞核和(或)胞膜內中均有表達(見圖2、3)，對照組

wnt/β-catenin途徑的異常激活是宮頸癌重要的發病機制[1]，可以通過檢測β-catenin的表達水平來判斷wnt/β-catenin信號通路的激活水平。wnt/β-catenin信號通路在紫杉醇治療宮頸癌中的作用機制目前尚不明確，因此, 探討紫杉醇治療宮頸癌過程中對wnt/β-catenin信號通路的影響對臨床將有重要的指導意義。本研究以不同濃度紫杉醇對宮頸癌Caski細胞株增殖的影響為立足點，用免疫組化法檢測wnt/β-catenin信號通路關鍵蛋白β-catenin蛋白表達，以研究紫杉醇對宮頸癌腫瘤細胞wnt/β-catenin信號通路的影響，進而探索該信號通路在紫杉醇抗腫瘤作用中的具體機制。

表1　紫杉醇對宮頸癌Caski細胞抑制

注：同一組與24h時間組段相比較P<0.05；同一時間與0.001μg/ml濃度相比較P<0.05。

棕黃色顆粒者更致密，呈團塊狀。實驗組陽性率為39.3%，對照組陽性率為71.7%。實驗組中β-catenin蛋白表達陽性率明顯減少(P<0.05)。

圖2對照組Caski細胞中圖3紫杉醇作用后Caski細胞中

β-catenin蛋白(s-p法×400)β-catenin蛋白(s-p法 ×400)

3討論

紫杉醇類屬于細胞周期特異性藥物，其藥理機制主要是通過結合到微管蛋白上，阻滯其解聚成亞單位，并促進微管蛋白的聚合，在婦科惡性腫瘤治療中起著越來越重要的作用[2]。隨著分子生物學技術在惡性腫瘤基礎研究中的應用，發現腫瘤的形成發展過程中，越來越多的基因及信號通路參與其中，其中wnt/β-catenin通路便是研究的熱點之一。wnt/β-catenin信號通路在促進及維持腫瘤干細胞的增殖、成瘤性、耐藥性等諸多方面起著重要作用，該作用在白血病、淋巴癌、皮膚癌等腫瘤中已被證實[3]。β-catenin蛋白是一種多功能蛋白，是wnt/β-catenin信號傳導通路的核心元件，其充當轉錄因子作用，在細胞核內啟動并激活促使細胞分裂的基因，其介導的wnt/β-catenin信號傳導通路異常激活在多種惡性腫瘤的發生發展過程中起重要作用[4]。

目前關于紫杉醇對wnt/β-catenin信號傳導通路的作用機理尚不明確，因此檢測β-catenin蛋白的異常表達情況可幫助判斷wnt/β-catenin信號通路在紫杉醇治療宮頸癌過程中的可能作用機制。本實驗采用不同濃度紫杉醇溶液分別作用Caski細胞24h、48h及72h，通過MTT比色法檢測宮頸癌Caski細胞凋亡情況，實驗結果顯示，不同濃度紫杉醇均能造成Caski細胞的凋亡，其對增殖的影響呈劑量效應和時間效應關系。紫杉醇實驗組β-catenin蛋白表達水平在Caski細胞中表達明顯下降。本實驗揭示了紫杉醇作用Caski細胞的可能機制：紫杉醇導致Caski細胞內β-catenin蛋白水平下降，

使wnt/β-catenin信號通路中關鍵的信號介質減少，進而使信號傳遞過程中斷受阻，進而影響Caski細胞的繼續增殖，誘導細胞凋亡。盡管本實驗對紫杉醇藥物影響wnt/β-catenin信號傳導通路具體分子學機制未做相關闡述，但為進一步探討紫杉醇藥物調控腫瘤信號傳導通路提供了基礎。

參考文獻

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[2]Van den Bent MJ，Hegi ME，Stupp R. Recent developments in the use of chemotherapy in brain tumours〔J〕. Eur J Cancer,2006,42(5):582-588.

[3]Kestler HA,Kuhl M.From individual Wnt Pathways towards a Wnt signaling Network〔J〕.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，2008，363(1495):1333-1347.

[4]Garcia AA,Blessing JA,Vaccarello L,etal.Gynecologic oncology group study.phase ii clinical trial of docetaxel in refractory squamous cell carcinoma of the cervix:a gynecologic oncology group study〔J〕.Am J Clin Oncol,2007,30(4):428-431.

(編輯落落)

收稿日期2014-10-13

中圖分類號：R737.33

文獻標識碼：A

文章編號：1001-7585(2015)03-0305-03