結合分子相似性、藥效團和分子對接篩選新的HIV-1蛋白酶抑制劑

汪　瀅，唐國榮，劉澍楠

(中國人民解放軍第476醫院，福州 350002)

結合分子相似性、藥效團和分子對接篩選新的HIV-1蛋白酶抑制劑

汪瀅，唐國榮，劉澍楠*

(中國人民解放軍第476醫院，福州 350002)

摘要：結合分子相似性、藥效團和分子對接建立兼顧計算效率和預測準確度的HIV-1蛋白酶抑制劑篩選方法。首先通過對現有HIV-1蛋白酶抑制劑分子進行相似性分析，選取代表性的HIV-1蛋白酶抑制劑作為模板分子，構建和優化藥效團模型，并從1萬個化合物中優先篩選出500個化合物。而后采用分子對接方法進一步考察化合物與HIV-1 蛋白酶結合情況，得到 4個新的活性候選化合物，并進行其結合自由能計算和抗突變性分析。結果表明新候選化合物ST025723和HIV-1蛋白酶表現出較好的相互作用和抗突變性，具有深入研究的價值，同時也證明分子相似性、藥效團和分子對接相結合能夠快速有效地發現新穎活性候選化合物。

關鍵詞：HIV-1蛋白酶抑制劑；分子相似性；藥效團；分子對接

獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的傳染病，對公共健康構成嚴重威脅[1]。HIV蛋白前體由結構基因gag、pol和env編碼而成[2]。HIV-1蛋白酶是HIV病毒粒子組裝、成熟過程的關鍵酶，其主要功能是特異性地裂解gag和gag-pol多聚蛋白前體形成具有活性的病毒結構蛋白和酶[3,4]。HIV-1蛋白酶以二聚體形式發揮其活性，干擾二聚體形成或破壞已形成的二聚體能夠有效地抑制其活性[5]。因此，HIV-1蛋白酶可作為抗艾滋病治療的重要靶點，其抑制劑也成為目前抗HIV藥物復合療法的重要組成部分[6,7]。近二十年，FDA批準了9個HIV-1蛋白酶抑制劑藥物，其中包括最新的Darunavir。但是HIV病毒變異率高，耐藥病毒株不斷出現，而且耐藥毒株的耐藥性越來越強[8,9]。Darunavir是至今研發出的活性最高的HIV-1蛋白酶抑制劑，也是唯一一個被美國FDA 批準作為治療耐藥型HIV-1 的蛋白酶抑制劑。但是，Darunavir具有肝臟毒性，特別是對伴有乙型和丙型肝炎病毒感染的HIV患者[10]。另外，Darunavir還可誘發嚴重的過敏反應[11]。因此，開發新型的、安全性高的、抗耐藥性的HIV-1蛋白酶抑制劑具有重要意義。

目前，虛擬篩選包括分子對接、藥效團、三維定量構效關系以及機器學習，已經成功應用于先導化合物的發現[12-15]。雖然單獨的分子對接以及單個分子為模板的藥效團模型已被用于HIV-1 蛋白酶抑制劑的發現[16,17]，但這并不能滿足海量化合物庫篩選和新穎活性骨架捕獲的需要。DataWarrior是全新的集分子描述符計算和數據分析于一體的化學信息學軟件，能夠利用自帶的分子描述符對小分子化合物進行快速的相似性分析和聚類[18]。LigandScout是基于3D-藥效團模型進行精確虛擬篩選的集成平臺。支持基于配體或基于結構的藥效團建模，還包含基于藥效團的疊合，共有藥效團特征的創建，以及自動生成ROC曲線以便進行性能評估。其篩選速度快，特別適合于大化合物庫的篩選[19]。

因此，本研究采用分子相似性，藥效團和分子對接相結合的策略。首先，對已知的HIV-1蛋白酶抑制劑進行相似性分析，選出代表性化合物作為模板建立藥效團篩選模型，根據Darunavir和HIV-1蛋白酶間的相互作用指導藥效團模型的藥效團特征優化，并利用已報道的HIV-1蛋白酶抑制劑作為訓練集對模型篩選能力進行評價。最后，我們將優化好的模型應用于化合物庫篩選，對打分較高的化合物進行分子對接，觀察化合物與HIV-1 蛋白酶的結合情況，選取活性候選化合物進行結合自由能計算和抗突變性分析。

1材料與方法

1.1　軟件和材料

采用軟件DataWarrior (開源軟件)，LigandScout 3.12 (Inte: Ligand)，PyMOL (開源軟件)，Gold 軟件 (CCDC Software Ltd)，MOE (Chemical Computing Group Inc.) 和Discovery Studio Visualization (Accelrys)。蛋白質晶體結構下載于PDB (Protein Data Bank)，收集文獻已報道的HIV-1蛋白酶抑制劑組成訓練集(Training Set)[20-23]， 類藥性偽活性化合物庫(Drug-Like Ligand Decoys Set)來自Schr?dinger，化合物篩選庫采用TimTec的多樣化合物篩選庫(Diversity-screening-set)。

1.2　藥效團模型的建立、優化及驗證

化合物包括Training Set、Decoys Set 和Screening Set均采用LigandScout 中的OMEGA生成ldb 格式的化合物構象數據庫，單個化合物最多構象限制為300。Darunavir的HIV-1蛋白晶體復合物(PDB ID: 4LL3)從PDB獲得，并利用PyMOL對Darunavir和HIV-1蛋白酶的相互作用模式進行分析。采用DataWarrior對141個已知的HIV-1蛋白酶抑制劑進行相似性分析，選取7個代表性的化合物進行藥效團模型構建，并根據Darunavir和HIV-1蛋白酶的相互作用分析指導藥效團特征的優化。在模型建立和優化過程中，我們利用訓練集和類藥性偽活性化合物庫對模型進行評價，考察模型對已知HIV-1蛋白酶抑制劑的富集能力。

1.3　基于藥效團模型的化合物篩選和分子對接

將優化好的藥效團模型作為提問結構，應用LigandScout分子模擬軟件包對TimTec公司的多樣化合物篩選庫(含10 000個化合物)進行試篩，得到與所建藥效團模型配備較高的前500個化合物。再利用Gold軟件對這些化合物進行分子對接，以HIV-1蛋白酶晶體結構(PDB ID: 4LL3)作為受體篩選模型，定義復合物中Darunavir結合區域作為活性位點，綜合考慮受體—配體之間的極性和非極性相互作用評價對接結果。最后選取打分高于或相當于Darunavir的化合物作為活性候選物。

1.4　結合自由能計算和抗突變性分析

現有的分子對接軟件很少或很難考慮受體大分子的柔性, 采用MOE軟件包中的MMFF94力場進行能量優化可以同時考慮受體和配體的柔性, 得到更為合理的結合自由能[24]。在HIV-1 蛋白酶抑制劑研發過程中，藥物學家已經發現了至少50種HIV蛋白酶抗性突變，Darunavir 的抗耐藥性源于它能與蛋白酶活性中心的氨基酸骨架形成廣泛而強的氫鍵作用，而且大部分作用殘基并不位于突變位點，能有效抵抗蛋白酶局部突變所致的親和力下降[9]。因此分析活性候選物的氫鍵形成位點和蛋白酶突變位點，有助于了解化合物的抗突變性。

2結果與討論

2.1　蛋白晶體復合物及相互作用分析

從蛋白數據庫(PDB)下載Darunavir的HIV-1蛋白酶晶體結構(PDB ID: 4LL3)。通過Discovery Studio Visualization對結構進行分析，可以看到晶體復合物中HIV-1蛋白酶由AB兩條鏈共同構成了抑制劑Darunavir的結合口袋(見圖1a)。采用PyMOL軟件對結合口袋進行相互作用分析，發現Darunavir與活性口袋匹配較好，能夠同HIV-1蛋白酶上的ASP-25，GLY-27，ASP-29以及ASP30氨基酸殘基產生強的氫鍵相互作用(見圖1b)，另外Darunavir 還可與HIV 蛋白酶的Leu23，Gly49，Ile50，Pro81，Vla82以及Ile84等殘基有較強的范德華相互作用，所有這些特性對于它的高活性和抗突變型蛋白酶的能力來說都是至關重要的。

圖1　Darunavir和HIV-1蛋白酶的晶體復合物結構及其相互作用Fig.1　The crystal structure of Darunavir bound to HIV-1 protease and their interactions

2.2　藥效團的構建、驗證和優化

利用DataWarrior對已知的HIV-1蛋白酶抑制劑進行相似性分析(見圖2a)，發現其大致可分為7類，每類的中心分子被選作模板分子。利用LigandScout軟件構建藥效團模型并進行優化和驗證，優化后的藥效團模型如圖2b所示，其包括3個芳香環，4個氫鍵受體和2個氫鍵供體。采用訓練集(由141個已知的HIV-1蛋白酶抑制劑組成) 和類藥性偽活性化合物庫 (999個來自Schr?dinger的類藥分子構成) 對模型進行評價，考察藥效團模型將活性分子和偽活性分子(Decoys)分開的能力。通過計算ROC曲線下面積(Area Under Curves, AUC)和1%，5%，10%，100% 四個水平的富集因子(Enrichment Factors, EFs)作為模型驗證的基準。如圖3所示，最后優化好的模型AUC為0.80，四個水平的EFs分別為：8.1，7.8， 5.2和2.8。

圖2　HIV-1蛋白酶抑制劑的相似性分析和以代表性分子為模板構建的藥效團模型Fig.2　The similarity analysis of known HIV-1 protease inhibitors using DataWarrior and the pharmacophorederived from seven representative HIV-1 protease inhibitors using LigandScout

圖3　藥效團模型篩選能力的評價(AUC=0.80)Fig.3　The screening performance of the optimizedpharmacophore model (AUC=0.80)

2.3　藥效團虛擬篩選和分子對接

首先利用優化好的藥效團模型對TimTec的Diversity-screening-set (10 000個化合物)進行篩選，保留打分較高的前500個化合物，然后利用Gold軟件進行分子對接。為了檢驗對接方法的可靠性，選擇將原有配體Darunavir重新對接到HIV-1蛋白酶受體中，然后比較配體對接后預測構象與晶體構象的差異。結果預測構象可以重現原晶體中的構象，表明分子對接參數能夠有效用于化合物的進一步篩選。最后從分子對接結果中選取打分高于或相當于Darunavir的4個候選化合物做進一步分析(見表1)。如圖4所示，對獲得的4個候選化合物與HIV-1蛋白酶間的相互作用進行分析，發現候選化合物ST070845可與HIV-1蛋白酶的ARG-8，ASP-25，ASP-30以及GLY-48形成多個氫鍵，而且分子中的苯并吲哚母核可以很好地嵌入疏水口袋。化合物ST088084中的三氮唑母核能夠同時和蛋白酶A、B兩條鏈的ILE50殘基形成強的氫鍵作用，另外其末端氨基亦可與蛋白酶中的GLY-48殘基形成氫鍵。化合物ST025723與蛋白酶的ASP-25和GLY-27殘基產生氫鍵相互作用，這兩個殘基也是Darunavir的作用殘基。化合物ST025679的酰胺結構可與ILE-50形成氫鍵，同時其甲氧基也可與ASP-30殘基有氫鍵作用。

表1　化合物的分子對接打分，結合自由能和氫鍵作用

2.4　結合自由能計算、抗突變性分析和結構新穎性評價

分子對接可以快速地對配體小分子進行一定空間的構象搜索，以保證在合理的時間內從大量數據庫中搜索到類藥的化合物。但是，現有的分子對接軟件很少或很難考慮受體大分子的柔性，難以在對接時適時調整受體的構象。對受體—配體復合物進行能量優化和結合自由能計算可以同時考慮受體和配體的柔性，受體活性中心的構象可以隨著配體構象的改變而改變, 真正做到“誘導契合”， 得到更為合理的結合自由能[25]。通過結合自由能計算，發現這些化合物的結合自由能要高于Darunavir，但是化合物ST025679的結合自由能非常接近于Darunavir，另外化合物ST088084和ST025723也顯示出較低的結合自由能，而化合物ST070845雖然對接打分較高，但也呈現出較高的結合自由能。耐藥性是艾滋病治療過程中的一個重要問題，主要原因是HIV-1蛋白酶序列中的某些氨基酸發生了抗性突變，按照它們在蛋白酶結構中的位置，又可以分為活性位點突變和非活性位點突變，其中活性位點突變占了較大比重。根據HIV蛋白酶常見突變位點和4個新活性候選化合物的作用殘基，其中化合物ST088084和ST025679可能會因I50V突變導致其活性下降[26,27]。最后，采用FCFP_4和MACCS兩種分子指紋對化合物ST025723與FDA批準上市的9個HIV-1蛋白酶抑制藥物進行相似性分析，發現ST025723與藥物Atazanavir最為相似，其相似系數分別為0.34和0.45，說明ST025723結構新穎，不同于已有的HIV-1蛋白酶抑制藥物。因此，綜合考慮結合自由能、抗突變性和結構新穎性，化合物ST025723具有更潛在的深入研究價值。

圖4 　HIV-1蛋白酶抑制劑候選化合物和HIV-1蛋白酶的相互作用模式Fig.4　The interactions between candidate inhibitors and HIV-1 protease

3結論

HIV-1蛋白酶是HIV復制過程中的關鍵酶，將其作為藥物靶點并開發其抑制劑具有廣闊的前景。本研究采用分子相似性、藥效團和分子對接相結合的虛擬篩選策略，使各自的優點得到了很好的融合。由于藥效團篩選速度快，適合于對大化合物庫進行快速篩選。而后采用分子對接，對藥效團篩選結果進行進一步的篩選，而且還能對獲得的候選化合物進行相互作用模式分析，最后采用結合自由能計算，同時考慮受體和配體的柔性，使活性評價更為合理和準確。此外，通過化合物結合位點和HIV-1蛋白酶常見突變位點進行抗突變性分析，進一步從篩選到的活性候選化合物中挑選出具有抗耐藥性的活性化合物。該策略確保了篩選結果的質量，達到在更短時間內更高效地發現抗耐藥活性候選化合物的目的。根據對TimTec多樣化合物庫篩選結果，4個活性最好的候選化合物，雖然結構和現有HIV-1蛋白酶抑制劑Darunavir存在較大差異，但其作用模式卻類似，這也充分展現了組合藥效團模型在捕獲新穎活性骨架方面的優勢。

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Discovery of new HIV-1 protease inhibitors by integrating molecular

similarity,pharmacophore and docking methods

WANG Ying, TANG Guorong, LIU Shunan*

(DepartmentofPharmacy,The476thHospitalofPLA,Fuzhou350002,China)

Abstract：An efficient and accurate method was established for HIV-1 protease inhibitor screening by integrating molecular similarity, pharmacophore and docking methods. First, the similarity of known HIV-1 protease inhibitors was analyzed, and representative inhibitors were chosen as templates to build pharmacophore model for database screening. Five hundred compounds were picked out from 10 000 compounds by pharmacophore screening, which were further submitted to docking experiment. Four new candidate compounds were obtained, and their binding free energies and antimutagenic abilities were further evaluated. The candidate compound ST025723 showed good interactions with HIV-1 protease and antimutagenic ability,and deserved to be further studied.Therefore, the combination of molecular similarity, pharmacophore, and docking could be an efficient strategy to discover novel active candidates.

Keywords：HIV-1 protease inhibitor;Molecular similarity;Pharmacophore;Docking

中圖分類號：R91

文獻標志碼：A

文章編號：1672-5565(2015)04-244-07

doi:10.3969/j.issn.1672-5565.2015.04.07

作者簡介：汪瀅，女，藥師，研究方向：化合物數據庫的構建與虛擬篩選；E-mail：yingwang912@163.com;*通信作者：劉澍楠，男，主任藥師，研究方向：創新藥物研究與藥學信息學；E-mail：liusnfj@gmail.com.

收稿日期：2015-10-14;修回日期：2015-11-17.