hsa-miR-342-3p生物信息學分析

馬占兵,耿 芝,焦海燕,2,霍正浩,2*

(1.寧夏醫科大學基礎醫學院醫學遺傳系與細胞生物學系,銀川 750004；

2.寧夏回族自治區生殖與遺傳重點實驗室, 銀川 750004)

hsa-miR-342-3p生物信息學分析

馬占兵1，2,耿 芝1,焦海燕1,2,霍正浩1,2*

(1.寧夏醫科大學基礎醫學院醫學遺傳系與細胞生物學系,銀川 750004；

2.寧夏回族自治區生殖與遺傳重點實驗室, 銀川 750004)

摘要：通過生物信息學方法預測hsa-miR-342-3p靶基因及其功能機制。檢索PubMed 有關hsa-miR-342-3p的研究報道并進行功能分析；檢索miRBase獲取hsa-miR-342-3p序列；通過TargetScan, Pictar 和PITA數據庫預測靶基因并取交集,對其進行組織和疾病特異性表達譜分析、功能富集分析(GO enrichment analysis)、信號轉導通路富集分析(Pathway enrichment analysis)和蛋白質相互作用網絡分析(PPI analysis)。結果發現： hsa-miR-342-3p序列在多物種間具有高度保守性; hsa-miR-342-3p在腎臟組織和急性淋巴細胞性白血病、乳腺癌疾病中表達水平較高(RPM≥1 000)；預測得到14個hsa-miR-342-3p靶基因；靶基因分子功能分別富集于轉化生長因子活性、DNA結合和蛋白激酶激活等(P<0.05); hsa-miR-342-3p靶基因GO生物學過程主要集中于大分子代謝抑制，肺部組織發育、呼吸系統發育及管狀組織發育建成(P<0.05)；細胞信號通路主要富集于TGF-Beta信號通路、細胞因子、受體作用信號通路及前列腺疾病信號通路(P<0.01)。hsa-miR-342-3p在體內分布廣泛，預測的靶向TGF-Beta信號通路可能在疾病發生中發揮重要調控作用，是具有潛在研究價值的生物學靶標。

關鍵詞：hsa-miR-342-3p;靶基因；基因本體;信號通路;生物信息學

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度約在22個核苷酸(nt)左右，具有轉錄后水平調控功能的內源性非編碼單鏈小RNA分子[1]。研究證明,miRNA在轉錄或轉錄后水平上調節一部分信號分子參與細胞發育、分化、增殖凋亡和新陳代謝等多種生理過程[2]。miRNA-342-3p是一個被為廣泛研究的微小RNA分子，通過文獻分析表明其主要在腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌及結腸癌等癌癥中發揮抑癌作用[3-6]。hsa-miR-342-3p分子可能與細胞周期調控、DNA損傷修復等有關，但其具體作用靶標和信號通路，尚待深入研究。目前，miRNA靶標預測算法均需要運用到序列互補配對特性，熱力學穩定性，及進化保守性等特征，聯合使用不同算法的靶標預測數據庫交叉預測可有效降低預測的假陽性率[7]。miRNA作用功能復雜，單一miRNA可有多個靶基因，目前研究預測每個 miRNA 將可能會調控 200 個左右的基因，而多個miRNAs也可交叉調控單一靶標。因此，有效預測miRNA靶基因并對其進行系統生物學分析是研究其作用機制的重要環節之一[8]。基于多算法交叉的靶標預測，結合靶標基因組織表達特異性等信息，可快速而有效地獲取靶基因信號通路和調控網絡等重要信息，并有可能挖掘得到潛在的生物學功能信息。本研究通過靶標預測，數據整理和信息分析,獲得相關重要信息，以期為進一步驗證hsa-miR-342-3p功能提供數據支持，為探索hsa-miR-342-3p在癌癥中的作用機制和生物學功能提供可能的理論依據。

1資料與方法

1.1　hsa-miR-342-3p特異性表達譜分析

利用Human MiRNA Expression Database (http://bioinfo.life.hust.edu.cn/smallRNA/index.php)在線工具檢索獲得hsa-miR-342-3p在不同組織和疾病中的RPM(Reads Per Million reads)數據，獲得hsa-miR-342-3p在不同組織和疾病中特異性表達豐度信息，為靶基因組織和疾病定位及功能研究提供更多信息。

1.2　靶基因數據集獲得

利用 miRBase (http://www.mirbase.org/) 在線工具獲得hsa-miR-342-3p堿基序列、染色體定位和不同物種序列比對信息。分別使用TargetScan (http://www.targetscan.org)、Pictar(http://pictar.mdc-berlin.de/)和PITA(http://genie.weizmann.ac.il/)三種數據庫獲得hsa-miR-342-3p靶基因預測結果,提取靶基因GenBank ID或基因Symbol，并將其統一映射為GenBank ID，獲取三種預測結果的交集作為進一步分析的靶基因數據集。

1.3　靶基因功能及表達分析

檢索PubMed 關于hsa-miR-342-3p的相關研究，同時，提交靶基因至GeneCards(http://www.genecards.org/)數據庫，獲取靶基因功能信息。使用Human-Bodymap (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-513/)在線數據庫獲得靶基因在疾病和組織中的特異性表達信息。

1.4　富集分析

基因本體GO(Gene Ontology)和代謝通路KEGG富集分析采用Bioconductor GOstats包完成[9]。GOstats作為Bioconductor項目重要的基因功能注釋和富集軟件,可完成基因產物所有的注釋,也可通過查詢單一GO術語得到具有這個注釋的所有基因產物。通過該軟件獲得靶基因的GO號及其層次分類注釋信息,包括細胞組分(Cellular component), 細胞分子功能(Molecular function, MF)和生物學過程(Biological process, BP)等。利用KEGG數據庫完成通路富集分析，對預測出的相關靶基因進行信號通路富集分析,并計算OR值和P值。

1.5　蛋白質互作網絡分析

將預測靶蛋白名稱列表提交至STRING(http://string-db.org/)蛋白質互作分析數據庫[10]，選擇物種為HumanSpecies，其它參數默認，執行蛋白質相互作用網絡分析。

1.6　統計學分析

GO分析以高頻蛋白編碼基因為背景基因，采用超幾何分布方法計算P值，以P<0.05為相對于背景具有統計學意義閾值,得到基因集合在GO類別上的富集信息。KEGG富集的P值采用DAVID數據庫附帶的Fisher Exact Test軟件計算P值,以P<0.05為顯著性閾值,得到基因集合相對于背景具有統計學意義的信號通路。上述統計分析和計算均在Bioconductor3.0[11]平臺上完成。

2結果分析

2.1　hsa-miR-342-3p同源性分析

人類成熟hsa-miR-342-3p序列號為MIMAT0000753,位于14q32.2。通過對小鼠、大鼠、黑猩猩等5個哺乳物種的miR-342-3p序列分析，發現人類成熟hsa-miR-342-3p分子“42-ucucacacagaaaucgcacccgu-63”23個堿基在各個物種間高度保守,見表1。

表1不同物種中hsa-miR-342-3p的保守序列

Table 1Conserved sequence of hsa-miR-342-3p in different species

物種miRNA名稱保守序列人hsa-miR-342-3p42-ucucacacagaaaucgcacccgu-63小鼠mmu-miR-342-3p61-ucucacacagaaaucgcacccgu-83大鼠rno-miR-34261-ucucacacagaaaucgcacccgu-83黑猩猩ptr-miR-34260-ucucacacagaaaucgcacccgu-82獼猴mml-miR-34261-ucucacacagaaaucgcacccgu-83

2.2　hsa-miR-342-3p表達譜結果

Jing Gong 等[12]研究指出，人體不同組織樣本和疾病中大約70%的成熟 miRNAs 低表達或不表達 (RPM<1), 只有大約9% 的已知 miRNAs 處于相對高水平表達 (RPM≥100)。如圖1所示，利用HMED數據庫檢索，發現hsa-miR-342-3p在很多不同組織和疾病樣本中都高表達，特別是在急性淋巴細胞性白血病(ALL)、乳腺腫瘤(Breast tumor)及腎臟(Kidney)表達水平較高(RPM≥1 000)。

圖1　hsa-miR-342-3p 在不同組織和疾病中的平均表達水平Fig.1　Average expression level of hsa-miR-342-3p gene in different tissues and diseases

2.3　hsa-miR-342-3p靶基因預測

采用miRNA靶基因數據庫TargetScan、Pictar和PITA預測hsa-miR-342-3p靶基因，結果分別得到155、55和1 950個靶基因，取交集后共得到14個靶基因，如圖2所示, 靶基因信息如表2所示。

圖2　不同數據庫預測所得靶基因交集Fig.2　Intersection of prediction target genes using different database

序號GENBANK登錄號基因名稱基因官方名稱1NM_000945proteinphosphatase3(formerly2B),regulatorysubunitB,alphaisoformPPP3R12NM_001005609ectodysplasinAeda3NM_001204bonemorphogeneticproteinreceptor,typeII(serine/threoninekinase)bmpr24NM_001429E1Abindingproteinp300EP3005NM_001546inhibitorofDNAbinding4,dominantnegativehelix-loop-helixproteinid46NM_002442musashihomolog1(Drosophila)MSI17NM_003339ubiquitin-conjugatingenzymeE2D2(UBC4/5homolog,yeast)ube2d28NM_006206platelet-derivedgrowthfactorreceptor,alphapolypeptidepdgfra9NM_006549calcium/calmodulin-dependentproteinkinasekinase2,betacamkk210NM_017519ATrichinteractivedomain1B(SWI1-like)ARID1B11NM_019106septin3SEPT312NM_033296Mof4familyassociatedprotein1Mrfap113NM_173822familywithsequencesimilarity126,memberBFAM126B14NM_182398ribosomalproteinS6kinase,90kDa,polypeptide5RPS6KA5

2.4　靶基因功能研究

使用Human-Bodymap測序數據平臺，將靶基因名稱列表提交至服務器，分析得到靶基因在人體不同組織的特異表達譜。如圖3所示，SEPT3基因只在腦、淋巴結和睪丸中表達，且在腦中高表達；MSI1基因只在腦、結腸、卵巢、前列腺和睪丸組織中表達；EDA基因在腦組織、白細胞、肝臟和肌肉中不表達；RPS6KA5基因在脂肪組織、腎臟、肝臟中不表達。ID4在白細胞中不表達；MRFAP1、UBE2D2、PPP3R1、BMPR2、EP300、CAMKK2、ARID1B、FAM126B基因具有廣譜性表達特性。

圖3　靶基因在正常人體組織的特異性表達分布Fig.3　Specific expression of target genes in normal human tissues

2.5　GO富集分析

將上述14個靶基因的Gene IDs分別投射至GO兩大應用功能上，成功顯著映射到8個GO術語上，結果發現其中14個基因全部具有GO分子功能注釋信息，其功能主要富集于轉化生長因子活性、DNA結合、核染色質結合以及蛋白激酶活性等(P<0.005)；14個基因全部具有生物學過程注釋信息，顯著富集于肺部發育、呼吸系統發育、管狀組織發育及正向調控生物大分子代謝等(P<0.005)，結果分別見表3和表4。

表3　預測靶基因(部分)GO分子功能分類結果(P<0.005)

表4　預測靶基因GO生物學過程分類結果(P<0.005)

2.6　代謝通路富集分析

在GO注釋分類的基礎上，利用已有生物通路數據，對基因集合中的14個基因進行生物通路富集分析。如圖4結果顯示，在經典通路數據庫KEGG中hsa-miR-342-3p預測靶基因集合顯著富集于TGF-beta信號通路(P=0.000)，可能由膜上BMPRII受體介導信號轉導，下游通路主要有ID4蛋白負調控核轉錄因子及由EP300蛋白完成細胞周期G1期調控。此外，還顯著富集于細胞因子及受體相互作用網絡(P=0.006)以及前列腺癌疾病通路(P=0.008),結果見表5。

表5　預測靶基因KEGG 通路數據庫富集分析結果(P<0.05)

圖4　KEGG顯著富集的信號通路Fig.4　Significant enrichment of signal pathway using KEGG

2.7　蛋白質相互作用網絡分析

預測得到hsa-miR-342-3p靶基因總數14個，根據STRING蛋白質相互作用數據的信息可以構建蛋白質互作網絡，根據該網絡拓撲中度的重要性對靶基因進行排序。其中排在前五位的分別是“PPP3R1”,“PDGFRA”,“MSI1”,“RPS6KA5”,“EP300”。結果如圖5所示。

圖5　靶基因蛋白質互作網絡Fig.5　Interaction network of target protein

3討論

miRNA在許多生物學過程中發揮重要調控作用，人類三分之一基因由其調控,特別的，miRNA表達譜異常與癌癥疾病發生密切相關[13-14]。hsa-miR-342-3p序列在多物種間高度保守，且在多種組織和疾病中廣譜表達，提示其可能具有廣泛的生物學功能。采用信息學方法，系統分析靶標基因功能和信號通路,對豐富和深入研究hsa-miR-342-3p疾病調控機制具有重要意義。

本文交叉預測得到hsa-miR-342-3p靶基因總共有14個，尚未見文獻報道證實其相互作用。有關hsa-miR-342-3p表達譜研究已表明其在乳腺癌、腎癌等癌癥中高表達。hsa-miR-342-3p靶基因GO注釋主要富集在轉化生長因子活性、DNA結合、蛋白激酶活性等分子功能調控和呼吸系統發育、管狀組織建成等生物學過程中。KEGG可對某一miRNA諸多靶基因所涉及信號通路進行整合富集分析，本研究KEGG通路分析發現hsa-miR-342-3p靶基因功能顯著富集于TGF-β信號通路、細胞因子信號通路以及前列腺癌疾病通路上。上述結果提示hsa-miR-342-3p不僅在脈管組織器官發育中起重要調控作用，而且可能通過靶向骨形態發生蛋白受體2(BMRRII)而轉導參與TGF-β信號通路，并通過下游ID4蛋白和EP300蛋白參與DNA損傷修復和細胞周期調控，其具體作用機制有待進一步驗證。胞內轉化生長因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)信號通路在胚胎的早期發育、免疫炎性反應、腫瘤以及機體代謝平衡中都扮演著非常重要的角色[15]。機體內TGF-β信號通路的激活受到非常精確的調控，研究其分子機制具有非常重要的基礎和應用意義。富集分析發現hsa-miR-342-3p靶向TGF-β信號通路組成蛋白,提示hsa-miR-342-3p可能通過調控TGF-β信號通路而參與腫瘤發生發展。

近年來研究發現miRNA廣泛參與了癌癥信號通路的調節，且與癌細胞的凋亡、轉移和浸潤密切相關[16，17]。hsa-miR-342-3p可能作為腫瘤抑制因子和激酶調控因子而參與癌癥病程。Wang等的研究表明hsa-miR-342-3p通過靶向DNA甲基化轉移酶DNMT而顯著抑制裸鼠結直腸癌細胞的生長與轉移[18]，Li等研究發現hsa-miR-342-3p的過度表達可抑制宮頸癌細胞系的增殖、遷移和侵襲[19]。Crippa E等研究發現過表達hsa-miR-342-3p可顯著降低ID4蛋白而提高乳腺癌抑制基因BRCA1的表達,抑制乳腺癌發展[20]。Ryan JL研究發現在EB(人類皰疹病毒病)感染人胃癌細胞后，會引發細胞周期調節因子ID4、血管生成因子HIF1a以及DNA修復因子BRCA1協同變化[21]。上述研究提示我們預測得到的hsa-miR-342-3p靶標ID4及下游分子響應網絡的存在。眾多miRNA受腫瘤抑制基因TP53激活而發揮轉錄后調控作用[22]。hsa-miR-342-3p靶標HIF1a和腫瘤抑制蛋白TP53存在密切相互作用，因此， hsa-miR-342-3p是否靶向ID4蛋白并協同HIF1a和TP53調控癌癥信號通路值得進一步實驗證實和深入研究。

4結論

通過生物信息學方法對hsa-miR-342-3p進行了系統的分析，結果顯示hsa-miR-342-3p在多種組織和疾病中表達，靶基因分布具有組織特異性，并可能通過調控多個靶基因而參與TGF-beta信號通路調節,在機體的多種生理、病理過程中發揮重要作用。hsa-miR-342-3p可作為結直腸癌、胰腺癌、乳腺癌等管狀組織相關癌癥的生物標志性分子[23]，具有重要的研究價值。本文篩選預測得到的14個候選基因，為我們后續進一步探索hsa-miR-342-3p與癌癥機制方面提供了初步的研究方向。

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Bioinformatics analysis of hsa-miR-342-3p

MA Zhanbing1, 2，GENG Zhi1，JIAO Haiyan1, 2，HUO Zhenghao1, 2*

(1.DepartmentofMedicalGeneticsandCellBiology,SchoolofBasicMedicalScience,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China；

2.KeyLabofReproductionandGeneticsofNingxiaHuiAutonomousRegion,Yinchuan750004,China)

Abstract：To predict the target genes of the hsa-miR-342-3p and its function by bioinformatics analysis. All relevant studies of hsa-miR-342-3p were searched in PubMed and reviewed. The sequence of hsa-miR-342-3p was obtained from miRBase. TargetScan, Pictar and PITA were used to do intersection dataset of the target genes of hsa-miR-342-3p. The bioinformatics analysis of the target genes of hsa-miR-342-3p involved tissue and disease specific expression profile analysis,enrichment (gene ontology, GO), signal transduction pathway enrichment and protein interaction network analyses. The results showed that hsa-miR-342-3p sequences were highly conserved in various species. hsa-miR-342-3p had relatively high expression in kidney and disease of ALL, breast cancer (RPM≥1 000). There were 14 target genes of hsa-miR-342-3p identified. GO analyses showed that hsa-miR-342-3p target genes were enriched in growth factor activity, DNA binding and protein kinase activity (GO molecular function，P<0.05)，and enriched in positive regulation of macromolecule metabolic process, lung development, tube development and respiratory tube development (GO biology process，P<0.05); Pathway analyses showed that the target genes set mainly located in TGF-Beta signaling pathway, cytokine-cytokine receptor interaction signaling pathway and prostate disease pathway (P<0.01).The conclusion is hsa-miR-342-3p may be involved in the diseases via TGF-Beta signaling pathway, which might be a potential biological marker for further investigation.

Keywords：Hsa-miR-342-3p; Target genes; Gene ontology; Pathway; Bioinformatics

中圖分類號：Q343.1

文獻標志碼：A

文章編號：1672-5565(2015)04-212-08

doi:10.3969/j.issn.1672-5565.2015.04.02

作者簡介：馬占兵，男，助教，研究方向:復雜疾病遺傳;E-mail:mabing_516@163.com.*通信作者：霍正浩,男，教授，研究方向:人類群體遺傳學; E-mail:huozhh@163.com.

基金項目：寧夏醫科大學2014年度校級科研項目(XM201401)。

收稿日期：2015-10-31;修回日期：2015-11-15.