基于電化學基因傳感器的冬蟲夏草及其偽品北蟲草的鑒別*

基于電化學基因傳感器的冬蟲夏草及其偽品北蟲草的鑒別*

★丁妍華*謝一輝張秀秀王瓊樊浩*

(江西中醫藥大學藥學院南昌 330004)

摘要：目的：構建一種能夠靈敏鑒別中藥冬蟲夏草及其偽品北蟲草的電化學基因傳感器。方法：β-環糊精修飾的具有特異性分子識別特性的金納米顆粒(Au-CDS)被用作電化學信號提供者和主體分子。用3’端標有dabcyl，5’端標有氨基的發卡探針DNA進行電極修飾，冬蟲夏草的DNA片段可以和該探針DNA形成雙螺旋結構，從而將目標雜交事件轉換為Au-CDS提供的電流信號，該信號變化可通過循環伏安法靈敏檢測，目標DNA特異性基因位點的微小差異可產生顯著的電流響應差異。結果：可靈敏檢測2.6×10-12M的目標DNA。結論：該傳感器為冬蟲夏草的快速鑒別提供了一種新方法和工具。

關鍵詞：冬蟲夏草基因鑒別；電化學傳感器；雙標記DNA探針；主客體識別

為了控制中藥質量、保證臨床用藥的安全有效，中藥鑒定成為中醫藥研究的重要工作。傳統的中藥材鑒別主要依據形態學特征和理化性質，但物種的差異歸根結底是由于它們的DNA序列不同，所以最具有決定意義的是分子生物學層次的鑒定。目前應用于藥用植物鑒別的分子生物學方法主要有：限制性片段長度多態性(RFLP) 、隨機擴增多態性DNA(RAPD)、擴增片段長度多態性(AFLP)、隨機引物PCR(AP-PCR)、DNA指紋技術(DAF)和生物芯片等技術[1]，也取得了一定成果：對雷公藤的ITS and 5S rDNA 序列進行分析，為雷公藤的分子鑒定提供了依據[2]。采用PCR直接測序技術測定五鶴續斷的18S rRNA基因核苷酸序列及大青葉核基因ITS2區,為這兩種中藥材的分子鑒定提供了依據[3-4]。通過對當歸及其混偽品中藥材rDNA ITS序列的分析，發現rDNA ITS序列特征可作為當歸及其混偽品藥材鑒別的有效分子標記[5]。電化學DNA傳感器因其具有不破壞測試樣品、不受溶液顏色影響、靈敏、快速、簡便、便于微型化等優點,已逐漸成為分子生物學研究中對DNA 序列進行直接檢測的方法之一[6]。但是目前來說，電化學DNA傳感技術應用于中藥材基因鑒定的研究是非常少的[7]。針對當今中藥市場假冒偽劣的冬蟲夏草混淆品的情況，構建一種操作簡單，靈敏，快速，便攜的基因鑒別電化學傳感器是一項很有意義的研究。

該課題組研究了一種基于4-4-二甲氨基苯基偶氮苯甲酸(dabcyl)與環糊精主客體分子識別作用電化學檢測均相溶液發生的DNA雜交的新方法[8-9]。環糊精(CDs)是一種內部有疏水性空腔而外部是親水的環形結構的低聚糖。這種特殊結構賦予環糊精及其衍生物特異的識別和包裹客體分子的能力。作者合成了一種表面固定了β-環糊精金納米顆粒(Au-CDS)，用作電化學信號提供者和具有特異性分子識別特性的主客體識別者。3’端標有dabcyl，5’端標有巰基的發卡DNA被用作探針DNA，并預先通過金硫鍵自組裝在金電極表面，如圖1所示，在傳感器的初始狀態，由于探針DNA莖環結構的空間位阻效應，dabcyl難以被溶液中Au-CDS。在目標DNA檢測時，探針DNA發生構型轉變，迫使dabcyl遠離電極表面，從而可被Au-CDS通過主客體識別捕獲，即可實現將目標雜交事件轉換為Au-CDS提供的電流信號。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑 β-CDs購自Sigma Aldrich化學集團；dabcyl標記的發卡DNA探針、三堿基錯配DNA以及完全不互補DNA均購自上海Sangon生物技術公司，并通過HPLC純化。冬蟲夏草以及北蟲草DNA是從中藥材中提取并鑒定。具體基因序列如下：dabcyl標記的冬蟲夏草基因發卡探針DNA(Probe DNA)：5’-SH- CCACGCATTTCGGGGCGTGG-DABCYL-3’；三堿基錯配序列(購買)：5’- GCCCCGTTTTG -3’；完全不互補序列(購買)：5’ -GCATTTCGGGG-3’；目標DNA(冬蟲夏草基因片段)： 5’-GCCCCGAAATG-3’；單堿基錯配DNA(北蟲草同等位置的基因片段)： 5’- CCCCCGAAATG -3’；其余化學試劑均購自中國上海鼎國生物科技公司；所有溶液均是由Millipore Milli-Q system超純水配制；所用試劑若無特殊說明，均為分析純。

1.2 儀器 原子力顯微鏡(SEM)(瑞士 Nanosurf EasyScan)；電化學分析儀(美國CHI 660)；電化學反應池(5mL)；電化學系統(鉑絲作對電極；Ag/AgCl(飽和KCl溶液)電極作參比電極；探針DNA修飾的玻碳電極(直徑3 mm)作為工作電極)。

參考文獻1.3 巰基環糊精(SH-β-CD)的制備 SH-β-CD合成并原有基礎上有所改進[10]。首先，取5.20g(20 mmol)三苯基膦 和5.05g(20 mmol)碘液加入20mL DMF溶液中，在氮氣保護下，邊攪拌邊加入1.10 g(1.0 mmol)β-CD，混合后的溶液在80℃條件下攪拌15h，然后濃縮到一半的體積，加入甲醇鈉的甲醇溶液(3 M, 8.0 mL)調pH9-10，并冷卻。將上述溶液置于室溫下30min以破壞反應過程中生成的酯，然后倒入100mL的冰甲醇溶液中，隨后再倒入500mL的冰水，生成沉淀。過濾出沉淀，并用水和甲醇洗滌，干燥，得到白色粉末狀SH-β-CD(1.56g, 0.82mmol)。將上述實驗得到的SH-β-CD(1.56g, 0.82mmol)溶于16mL DMF中，再加入0.48g(6.4mmol)硫脲，在氮氣保護下，加熱到70℃。反應19h之后，減壓使DMF下變成黃色油狀物并溶于90mL水中，剩余的反應物中加入0.42g(1.05mmol)氫氧化鈉,在氮氣保護下低溫回流1小時，得到的懸浮物用KHSO4酸化，濾出沉淀物，用蒸餾水洗凈，烘干。為了除去殘留的DMF，將得到的產品溶于水形成懸濁液，再加入極少量的KOH形成一個澄清的溶液，加入KHSO4的水溶液再沉淀。沉濾出沉淀物，真空干燥，得到黃白色粉末狀的SH-β-CD(0.85g，0.83mmol)，熔點134-136℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ5.92 (d, J = 6.0 Hz, 7 H), 5.82 (s, 7 H), 4.93 (s, 7 H), 3.68 (t, J = 6 Hz, 7 H), 3.61 (t, J = 7.5 Hz, 7 H), 3.19 (br d, J = 15 Hz, 7 H), 2.77-2.74 (m, 7 H), 2.13(t, J = 6.0 Hz, 7 H). MS (ESI) m/z [M + Na]+: 1269.1920。 圖7目標DNA檢測的標準曲線濃度范圍

1.4 巰基環糊精功能化的金納顆粒(Au-CDs)的制備 巰基環糊精功能化的金納米參照文獻合成[11]。取0.6mM的 HAuCl4的(H2O:DMSO=1∶4)溶液20mL，加入16mL含有8.0mg SH-β-CD 和 60.4mg NaBH4的DMSO溶液，混合均勻，在室溫下持續攪拌24h，之后加入32mL CH3CN，離心，棄去上清液，得到的沉淀分別用50mL CH3CN:DMSO (1∶1, v/v)和50mL無水乙醇洗滌，離心，棄去上清液。得到的樣品真空干燥后置于60℃環境下過夜，之后室溫保存。

1.5 羧基功能化的碳納米管改性玻碳電極的制備 將玻碳電極(直徑3mm)在砂紙和涂有Al2O3(粒徑在0.05 m 和 0.3 m之間)白漿的麂皮上仔細打磨干凈，隨后置于蒸餾水中超聲清洗。在超聲攪拌情況下，將1 mg羧基功能化的碳納米管溶解到1mL的蒸餾水中，溶液呈黑色。取5μL上述溶液，滴加到玻碳電極表面，置于紅外燈下干燥并形成黑色均勻的薄膜，即得到MCNTs/GCE。

1.6 Probe DNA修飾電極的制備 取5 μL 100 mg /mL EDC溶液滴加到 MCNTs/GCE電極表面，隨后立即再取5 μL 100 mg /mL NHS溶液滴加到電極表面。在濕度為100%環境下，將電極浸入到probe DNA溶液中反應2h。反應完全后，用去離子水沖洗電極表面，得到Probe DNA/MCNTs/GCE待用。

1.7 DNA電化學檢測 DNA檢測過程：首先將制備好的Probe DNA/MCNTs/GCE電極浸入含有target DNA和Au-CDs的溶液中，37℃反應1h，目標DNA與探針DNA形成雙鏈螺旋結構，迫使dabcyl遠離電極表面，如圖1所示，從而可以被Au-CDS通過主客體識別捕獲進入到納米顆粒表面的β-CD空腔中，這樣，Au-CDs即被帶到電極表面，將反應后的電極取出，去離子水充分洗滌后，再在1mL0.1M HCl溶液中在+1.25V(vs. Ag/AgCl)預處理120s使金納米顆粒氧化成AuCl4-,隨后在50mV脈沖幅度和50ms脈沖寬度下從+0.7V到0.0V掃DPV。在此電位掃描過程中，約在0.4V得到還原AuCl4-的良好電化學信號，可用于目標DNA的特異性識別和定量分析。

圖1　基于主客體識別技術構建的DNA電化學傳感器

2 結果和討論

2.1 雜交條件優化 雜交體系的pH及雜交溫度對Probe DNA與目標DNA交形成雙螺旋DNA結構有一定影響。因此，我們做了一系列的實驗來優化雜交體系。我們研究了pH6.5到pH8.0間雜交體系的酸度對雜交反應的影響，不同pH值環境下的DPV信號有著較為顯著的差異，如圖2所示， pH在7.2附近，得到最大的DPV信號，故選pH7.2為最適pH。如圖3所示。雜交溫度對雙螺旋DNA的形成同樣有影響，故而我們探索了25到40℃間不同溫度下0.1 M磷酸緩沖液中發生的雜交反應。DPV信號在35℃到40℃間出現平臺(圖3)，因此選擇37℃作為實驗雜交溫度。

2.2 基于主客體識別的冬蟲夏草基因電化學DNA傳感研究 為了研究基于主客體識別的電化學DNA傳感器的構建技術，我們進行了對比實驗。首先，將Probe/MCNTs/GCE浸入含有只含有Au-CDs的溶液空白中，在37℃條件下孵育1h,如圖4所示，只得到一個相對小的電流信號(a)。相反地，當Probe/MCNTs/GCE浸泡到包含target DNA 和Au-CDS的溶液中1h，我們能得到一個顯著的電化學信號(圖4)。上述實驗說明，當Probe DNA 和 Target DNA雜交之后，Probe DNA末端的dabcyl被Au-CDS上的環糊精捕獲，進而產生一個顯著的電化學信號。

圖2　不同pH下目標DNA的DPV信號

圖3　在不同的雜交溫度下，檢測8.4×10-7

圖4　空白PBS溶液與含2.8×10-10

2.3 基于主客體識別的電化學DNA傳感對冬蟲夏草及其偽品北蟲草的鑒別研究 該研究對電化學DNA傳感器的特異性進行了一系列試驗。使用傳感器對一系列不同的DNA進行了檢測，所得到的電流信號如圖所示，傳感器與完全非互補的DNA作用得到的電化學信號(圖5,a)與非特異性吸附所產生的信號(圖5,b)相近，同樣三堿基錯配的DNA也不能產生明顯的電信號(圖5,c)變化。這說明Probe DNA在未雜交時，保持莖環結構，有效阻礙了dabcyl被Au-CDs上的環糊精捕獲，在電極表面只有很小的非特異性吸附同時僅僅產生很小的DPV信號。當北蟲草基因序列雜交，得到較小的電化學信號(圖5,d)僅為冬蟲夏草基因(圖5,e)的三分之一左右,冬蟲夏草和北蟲草同等位置的DNA片段只有一個堿基不同，而得到的電化學信卻相差很大。顯著的信號差異表明探針 DNA能很好特異性識別目冬蟲夏草與北蟲草基因的SNP，該研究構造的電化學DNA傳感器能夠有效的區分冬蟲夏草與北蟲草基因的SNP，從而快速鑒別冬蟲夏草和北蟲草。

圖5　傳感器檢測不同目標DNA得到的DPV信號：(a)完全

該研究表明，不同濃度目標DNA，得到的作為雜交信號的AuCl4-的還原峰電流不同。如圖6所示，隨互補序列DNA濃度的連續增大，得到的DPV信號也相應增強。如圖7所示，DPV信號與目標DNA濃度在3.4×10-12到3.4×10-9M濃度范圍內呈對數關系，得到相關系數為0.9876的校準方程式y=1.109logx+1.3(x是DNA的濃度,單位：pM, y是峰電流)，檢測限為2.6×10-12M。

3 結論

該研究構建的電化學基因傳感器，能夠對2.6×10-12M的冬蟲夏草DNA片段具有較靈敏的電信號響應，解決了微量藥材的鑒定難題，為今后中藥材鑒定提供了新思路。基于分子識別技術的電化學DNA傳感器能夠特異性的識別基因片段差異極小的冬蟲夏草和北蟲草，保證了對冬蟲夏草高效精準的鑒定。電化學基因傳感器本身具有的不破壞測試樣品、不受溶液顏色影響、靈敏、快速、便于微型化等優點都預示著它在中藥鑒定中的廣闊前景。

圖6　Probe DNA/MCNTs/GCE分別不同濃度

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收稿日期：(2015-04-08)編輯：曾文雪

中圖分類號：R282.5

文獻標識碼：A

通信作者：樊浩 (1980一),男，副教授。研究方向：中藥鑒定和生物傳感器。E-mail:fanhao11@yahoo.com.cn。

基金項目：第一作者：丁妍華(1990—)，女，在讀碩士研究生。E-mail: dyh1107@126.com。