雞新城疫和禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗不同佐劑的免疫效果試驗(yàn)

曹　繪，李寶臣，李　漫，方維煥

(1.浙江大學(xué)動物預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所，浙江杭州 310058；

2.浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司)

?

雞新城疫和禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗不同佐劑的免疫效果試驗(yàn)

曹繪1，2，李寶臣2，李漫2，方維煥1

(1.浙江大學(xué)動物預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所，浙江杭州 310058；

2.浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司)

摘要：為評價(jià)雞新城疫和禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗不同佐劑的免疫效果，選用Marcol 52、T1和SNB白油及S71油佐劑與雞新城疫病毒和禽流感病毒混合制成滅活疫苗，免疫適齡SPF雞，比較不同佐劑對雞的安全性及新城疫和禽流感的血凝抑制(HI)抗體水平。結(jié)果表明，4種佐劑疫苗的安全性、穩(wěn)定性良好；應(yīng)用T1白油佐劑的滅活疫苗，免疫SPF雞產(chǎn)生的新城疫和禽流感HI抗體水平優(yōu)于其他佐劑，免疫后2周檢測新城疫和禽流感的抗體水平均合格，確定為最佳白油佐劑。

關(guān)鍵詞：雞新城疫；禽流感；滅活疫苗；佐劑優(yōu)化

雞新城疫(ND)是危害養(yǎng)雞業(yè)的主要傳染病之一，是一種急性高度接觸性傳染疾病，發(fā)病率和死亡率極高[1]。禽流感(AI)是由A型流感病毒(AIV)引起的烈性傳染病，H9亞型禽流感病毒感染雞群后，除了引起呼吸系統(tǒng)疾病，還影響生殖系統(tǒng)[2]。雞新城疫和禽流感是一種世界范圍的禽類疫病，給禽業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，免疫接種是控制雞新城疫和禽流感的有效方法。但是，如將雞新城疫和禽流感H9亞型疫苗分別接種，不僅工作量大，且對雞體應(yīng)激嚴(yán)重，故迫切需要生產(chǎn)能“一針防多病”的疫苗，雞新城疫和禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗則成功地解決了這一問題。

目前，雞新城疫和禽流感(H9亞型)滅活疫苗大多采用白油作為佐劑，司盤80和吐溫80作為乳化劑[3-4]。由于不同廠家白油佐劑制備和純化工藝的差異，篩選出免疫效果好、安全性高的油佐劑對雞新城疫和禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗產(chǎn)品質(zhì)量的提升有著重要意義。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1抗原雞新城疫病毒抗原和禽流感病毒(H9亞型)抗原由浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)并提供(詳見表1)。

1.1.2佐劑選用Marcol 52、T1和SNB三種白油佐劑，S71油佐劑(詳見表2)。

表1　雞新城疫病毒抗原和禽流感病毒

表2　佐劑來源及產(chǎn)品型號

1.1.3主要器材FA25 model乳化剪切機(jī)，IPQ-3禽用隔離器等。

1.1.4實(shí)驗(yàn)動物30-60日齡SPF雞和21-35日齡SPF雞，均由浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司質(zhì)量管理部動物房提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1病毒液的滅活及滅活檢驗(yàn)將制備所得的兩種病毒液分別加入適量滅活劑進(jìn)行抗原滅活，并按照2010年版《中華人民共和國獸藥典》第三部進(jìn)行滅活檢驗(yàn)[5]。

1.2.2疫苗制備將檢驗(yàn)合格的新城疫病毒液和禽流感病毒液按照1∶1比例混合，再將混合后的病毒液與佐劑按照1∶2比例乳化后制成疫苗。將使用Marcol 52、T1、SNB和S71佐劑制成的滅活疫苗分別命名為A、B、C、D疫苗組。

1.2.3無菌檢驗(yàn)根據(jù)《中國獸藥典》附錄所提供的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，取樣品1 mL接種于含有50 mL硫乙醇酸鹽的培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)72 h，將培養(yǎng)物移植至TG小管和GA斜面各兩支(0.2 mL/支)，1支在37℃培養(yǎng)，1支在25℃培養(yǎng)，另取1支GP在25℃培養(yǎng)，觀察7 d。

1.2.4性狀檢驗(yàn)各組滅活疫苗按照《中國獸藥典》進(jìn)行性狀檢驗(yàn)。

1.2.5安全檢驗(yàn)選用30-60日齡SPF雞10羽，每羽頸部皮下注射疫苗0.1 mL，觀察14 d內(nèi)有否出現(xiàn)因疫苗引起的局部和全身性不良反應(yīng)。

1.2.6效力檢驗(yàn)

1.2.6.1新城疫效力檢驗(yàn)選用30-60日齡SPF雞15羽，其中10羽每羽皮下注射疫苗0.2 mL，另5羽作為非免疫對照。免疫后21-28 d，每羽分別采血，分離血清，進(jìn)行HI抗體效價(jià)測定。

結(jié)果判定：免疫組HI抗體效價(jià)不低于1∶16(微量法)，對照組不高于1∶4(微量法)。

1.2.6.2禽流感效力檢驗(yàn)選用21-35日齡SPF雞15羽，其中10羽每羽皮下注射疫苗0.2 mL，另5羽作為非免疫對照。免疫后21-28 d，每羽分別采血，分離血清，進(jìn)行HI抗體效價(jià)測定。

結(jié)果判定：免疫組HI抗體效價(jià)不低于1∶64(微量法)，對照組不高于1∶4(微量法)。

2結(jié)果與分析

2.1疫苗檢驗(yàn)結(jié)果詳見表3、表4。

表3　不同油佐劑雞新城疫和禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗性狀檢驗(yàn)

表4　不同油佐劑雞新城疫和禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗安全性檢驗(yàn)

由表3和表4可見，各組滅活疫苗的滅活檢驗(yàn)、無菌檢驗(yàn)、性狀檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。注射部位無過敏反應(yīng)及局部不良反應(yīng)，疫苗吸收良好，未見形成肉芽組織。

2.2動物試驗(yàn)結(jié)果詳見圖1、圖2。

圖1　不同油佐劑雞新城疫和禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗免疫后新城疫HI抗體比較

圖2　不同油佐劑雞新城疫和禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗免疫后禽流感HI抗體比較

由圖1可見，新城疫抗體B組最高、免疫后14 d抗體水平檢測合格，21 d后4種油佐劑的抗體均值分別為1∶74、1∶111、1∶26和1∶26，均達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)，但C組和D組相對較低。

由圖2可見，禽流感抗體B組最高、免疫后14 d抗體水平檢測合格，21 d后4種油佐劑的抗體均值分別為1∶891、1∶2353、1∶446和1∶1552。通過對比不同時(shí)間的抗體水平，以T1為佐劑的B組滅活疫苗抗體水平最高，D組次之，A組和C組雖然符合國家標(biāo)準(zhǔn)，但抗體水平較低。

3小結(jié)與討論

免疫佐劑是指與抗原同時(shí)或先于抗原使用，能增強(qiáng)機(jī)體針對抗原的免疫應(yīng)答能力或改變免疫反應(yīng)類型的物質(zhì)[6]。選擇佐劑時(shí)不僅要考慮其免疫促進(jìn)作用，也要兼顧佐劑的安全性及佐劑與抗原適當(dāng)比例配制后疫苗的黏度、穩(wěn)定性等是否符合要求。

目前，滅活疫苗尤其是禽用滅活疫苗，通常使用的佐劑是礦物油佐劑，抗體滴度維持時(shí)間較長。但是，不同油佐劑對疫苗免疫效果的增強(qiáng)作用可能存在差異[7-8]，本試驗(yàn)選擇了4種進(jìn)口油佐劑，分別與雞新城疫和禽流感(H9亞型)病毒液配制成滅活疫苗，免疫接種適齡的SPF雞均未出現(xiàn)局部腫塊及不良反應(yīng)，說明4種佐劑的生物兼容性較好，易吸收，無毒副作用。

經(jīng)試驗(yàn)，4種進(jìn)口油佐劑配制的雞新城疫和禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗免疫適齡的SPF雞進(jìn)行效力檢驗(yàn)結(jié)果顯示，不同佐劑制備二價(jià)滅活疫苗的抗體效價(jià)確實(shí)存在明顯差異，只有T1作為佐劑的疫苗，免疫后2周抗新城疫病毒和流感病毒的抗體均可達(dá)到合格水平，其余佐劑則在免疫3周后才能達(dá)到合格水平。筆者認(rèn)為T1白油是雞新城疫和禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗的理想佐劑。

通過對不同佐劑的篩選來提高現(xiàn)有滅活疫苗的抗體水平和免疫保護(hù)效果具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，以T1為佐劑的雞新城疫和禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗的實(shí)際應(yīng)用效果有待進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)

[1]蔡寶祥.家畜傳染病學(xué)[M].北京.中國農(nóng)業(yè)出版社，1980:352.

[2]戚中田.禽流感病毒與人類禽流感[J].中國科學(xué)基金，2004,2:68-71.

[3]王學(xué)艷. NDV分離株F及HN基因的遺傳變異分析與核酸疫苗質(zhì)粒的構(gòu)建[D]. 西北農(nóng)林科技大學(xué),2008.

[4]李呈軍. 中國H9N2亞型禽流感病毒進(jìn)化分析與H5N1亞型禽流感病毒標(biāo)記疫苗的研究[D]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2005.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國獸藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:21-22.

[6]高澤乾，孫建男，武煒，等.獸用免疫佐劑研究進(jìn)展[J].唐山師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2012,34(2):45-51.

[7]叢秋實(shí),胡瑞鴻,鄭德富,鄭孝輝,姜麗萍.禽流感(H9)滅活疫苗白油佐劑的優(yōu)選試驗(yàn)[J]. 中國動物保健,2013(10)：10-12.

[8]施建春,楊惠萍,. 不同佐劑的新城疫疫苗免疫效果的研究[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2014(6)：23-25.

中圖分類號：S858.31

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1005-7307(2015)06-0001-003

收稿日期：2015-09-18