多指標正交優選雙龍顆粒水提工藝

洪巧瑜 張建軍 王克榮 王林元 李 偉

1.北京衛生職業學院，北京 100053；2.北京中醫藥大學，北京 100029

雙龍顆粒[1-2]系在中醫藥理論的指導下，在多年臨床實踐經驗的基礎上，結合現代醫藥研究成果，確定了雙龍顆粒處方。具有疏風解表、清肺化痰、降氣平咳的功能。臨床用于哮喘風哮證，證見時發時止，止時又如常人，發作前鼻癢，噴嚏，咳嗽，痰粘。雙龍顆粒由麻黃、地龍、防風、杏仁、甘草等中藥經提取加工制成的顆粒，方中各藥味所發揮的功用既相互獨立又相互協作，所含成分既有水溶性部位，也有脂溶性部位，如只選定一種指標成分進行提取工藝優選，難以保證制劑整體療效的發揮。為將各藥味中主要有效部位盡可能提取充分，本研究采用醇水雙提法[3-4]。

由于雙龍顆粒的制備工藝研究處方藥味較多，對提取工藝的優化用單一指標考察具有較大的片面性，本研究每條工藝路線都選定了多指標[5-6]來考察各提取因素，使提取工藝更具全面性和科學性。處方中部分藥物麻黃、黃芪、柴胡、苦杏仁、防風、地龍、甘草主要有效成分為水溶性成分，如生物堿類[7]、苷[8]、氨基酸[9]、香豆素類[10]，故選擇水作為溶劑，本研究選定對加水量、提取時間、提取次數作為考察因素，對工藝進行優選。由于處方藥味較多，對提取工藝的優化用單一指標考察具有較大的片面性。所以本文選定了以浸出物的量、一種生物堿為主、一種皂苷為輔的代表性指標來考察各提取因素，使提取工藝更具全面性和科學性。本研究采用正交設計法，以提取干膏量，鹽酸麻黃堿含量，苦杏仁苷含量為考察指標，對雙龍顆粒水提部分的加水量、水煮時間、提取次數三因素進行優選研究。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

鹽酸麻黃堿對照品（中國藥品生物制品檢定所提供，批號為0090-9801）；苦杏仁苷對照品（中國藥品生物制品檢定所提供，批號為110820-200403）；藥材為北京藥材公司提供，其余試劑均為色譜純。

1.2 儀器

島津SPD-10A 色譜柱為SinoChrom-BP（4.6mm×250mm，5μm）。

表2 水煮提取工藝L9（34）正交試驗表

2 水提工藝研究的方法

2.1 藥材吸水量的考察

按處方量稱取藥材麻黃9g、地龍6g、杏仁6g等，總計51g，加水浸泡24h，測定其吸水量為2 倍，浸沒藥材最小加水量為8 倍，以此作為設定加水量的依據。

2.2 水提工藝的正交試驗設計方案

為了提高藥物的提取效率，選取對提取影響大的對工藝中加水量（A），煎煮時間（B），煎煮次數（C）三個因素進行考察，同時，每個因素取三個水平，見表1。

2.3 水提工藝的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Hypersil ODS2（4.6mm×200mm 5μm）色譜柱，流動相：甲醇：0.1%磷酸溶液（5︰95），流速：1.0mL/min，檢測波長：207nm，柱溫：室溫，流速：1.0mL·min，理論板數：以鹽酸麻黃堿峰計算應不低于3000，以苦杏仁苷峰計應不低于5000。

表1 水煮提取工藝正交試驗因素水平表

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸麻黃堿10mg 置100mL 的量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取2mL 置25mL 的量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為鹽酸麻黃堿對照品溶液（1mL 含鹽酸麻黃堿約0.008mg）。再精密稱取苦杏仁苷10mg 置25mL 的量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取2mL 置25mL 的量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為苦杏仁苷對照品溶液（1mL 含苦杏仁苷約0.032mg）。

表3 水煎煮前浸泡時間比較實驗

2.3.3 供試品溶液的制備 精密量取2.1 項下1 ～9 號提取物約0.4g 置具塞錐形瓶中。精密加入甲醇5mL 密塞，稱定重量，超聲處理45min（制劑與半成品15min，苦杏仁回流1h），放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續濾液1mL，置中性氧化鋁柱（內徑1cm，100 ～200目中性氧化鋁，1.5g，干法裝柱）上，用50%甲醇洗脫至9mL，用50%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45um）濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.4 測定波長的選擇

對樣品進行全波長掃描，207nm、254nm 有最大吸收：但207nm 響應值較大，且在此波長下陰性樣品無干擾，故用207nm。

2.5 線性范圍

鹽酸麻黃堿進樣量麻黃堿在12.3 ～393.6μg范圍內呈線性關系，其回歸方程為Y=26.766X-0.0813（r=0.9997），苦杏仁苷在0.106 3-4.252 μg 范圍內呈線性關系，其回歸方程為：Y=1.13×106X+5.12×104（r=0.9995）。

3 水提工藝的正交試驗數據結果

按處方比例分別稱取麻黃9g、地龍6g、杏仁6g等，總計51g，提取，每次浸泡2h，按正交因素水平表提取，濃縮，干燥，粉碎過80 目篩，得水提藥粉備用。以出膏率、鹽酸麻黃堿含量、鹽酸麻黃堿總量、杏仁苷含量、杏仁苷總量為指標，對提取次數、提取時間、加水量采用正交試驗法進行優選。見表2。鹽酸麻黃堿的測定方法，參照中國藥典2010 版麻黃項下麻黃堿的高效液相測定法[11]。杏仁苷的測定方法，參照藥材制劑半成品中麻黃堿、偽麻黃堿和苦杏仁苷的同時定量研究[12]。

3.1 結果分析

按鹽酸麻黃堿總量進行方差分析，提取時間B 和加水量C 無顯著性差異，根據極差分析，綜合考慮出膏率，鹽酸麻黃堿含量的結果，最佳條件為A3B1C1；即提取三次，每次1h，加水量為8，6，6；按杏仁苷總量進行方差分析，煎煮次數A、提取時間B、加水量C 都有顯著性差異，根據極差分析，綜合考慮出膏率，杏仁苷含量的結果，最佳條件為A3B3C2，；綜合以上二指標，最佳條件確定為A3B3C2，即提取三次，每次2h，加水量為10，8，8。

3.2 驗證試驗及水提工藝參數浸泡時間的比較實驗

取藥材麻黃9g、地龍6g、杏仁6g 等，總計51g，加10，8，8 倍量水，分別浸泡0h，2h，提取3 次，每次2h，以出膏率、鹽酸麻黃堿含量、鹽酸麻黃堿總量、杏仁苷含量、杏仁苷總量為指標，用正交最優條件，對浸泡時間進行比較,見表3。

結果表明，水提取前浸泡2h 與浸泡0h 未見明顯差異，故確定不浸泡。按上述最佳工藝條件制成的雙龍顆粒水提部分最佳條件為不浸泡，提取3 次，每次2小時，加10，8，8 倍量水。按此最佳工藝條件得麻黃堿轉移率為68.86%；杏仁苷轉移率為92.78%，工藝合理。

4 討論

由于影響藥物提取的因素很多，而且這些因素相互作用，單一指標成分的控制難以體現中藥效應整體性特征；單一指標成分的變化情況，難以體現制備過程中整體成分的變化情況，以往的復方提取工藝優選，局限于用浸膏得率、某一指標成分的含量進行工藝優選，具有一定的局限性[13]。本實驗用多個指標進行評價比較合理。本處方中有九味藥材水提，其制劑工藝的評價如采用單一指標則代表性較差，用不同種類的成分作為評判指標其結果才有較廣泛的代表性。但由于不同藥材中的成分方中地位不一，含量不在同一數量級，故應以一種生物堿為主、一種皂苷為輔的代表性指標來考察各提取因素。麻黃堿為方中君藥麻黃的藥效成分，其所需提取條件為不浸泡，提取3 次，每次1h，加水量為8，6，6；而佐藥杏仁的藥效成分杏仁苷在該條件下轉移率亦不低于80%，從省時省工的角度出發提取條件為不浸泡，提取3 次，每次1h，加水量為8，6，6。

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