非小細(xì)胞肺癌VEGF-C的表達(dá)與LYVE-1標(biāo)記的微淋巴密度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

黃穗華 蔣 玲 鄧杰方

廣東醫(yī)學(xué)院附屬西鄉(xiāng)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東深圳 518101

淋巴管轉(zhuǎn)移是影響非小細(xì)胞肺癌（nonsmallcell lung cancer，NSCLC）患者預(yù)后的主要原因[1]。現(xiàn)有研究表明血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial cell growth factor C，VEGF-C）參與了腫瘤淋巴管生成和轉(zhuǎn)移過(guò)程[2-3]。探討NSCLC 患者VEGF-C 表達(dá)及其與微血管密度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系對(duì)于指導(dǎo)NSCLC 治療和預(yù)后具有重要的價(jià)值[4]。本研究探討了NSCLC 患者VEGF-C 蛋白表達(dá)與淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體-1（LYVE-1）標(biāo)記的微淋巴管密度（Lymphatic microvessel density，LMVD）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，有關(guān)結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2013 年5 月～2014 年10 月在我院確診并經(jīng)手術(shù)治療的NSCLC 患者共58 例為病變組。納入標(biāo)準(zhǔn)：病理學(xué)檢測(cè)確診；接受淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分析；對(duì)本研究知情同意。其中男41 例（70.69%），女17例（29.31%），年 齡36 ～74 歲，平 均（57.6±8.8）歲；TNM 分 期：Ⅰ期 12 例（20.69%），Ⅱ期23例（39.66%），Ⅲ 期20 例（34.48%），Ⅳ 期3 例（5.17%）；33 例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（56.90%），25 例未見(jiàn)轉(zhuǎn)移（43.10%）。選擇同期在我院接受檢查和治療的肺良性病變患者共12 例為良性組，男8 例（66.67%），女4 例（33.33%）；年齡35 ～75 歲，平均（58.2±8.5）歲；肺大皰4 例（33.33%），肺錯(cuò)構(gòu)瘤3 例（25.00%），肺外傷5 例（41.67%）。

1.2 免疫組化染色

10%甲醛固定并常規(guī)石蠟包埋病變組織，行5μm 連續(xù)切片，進(jìn)行HE 及免疫組織化學(xué)染色。美國(guó)R&D 公司提供VEGF-C、LYVE-1 單克隆抗體。免疫組化試劑盒（北京中衫公司提供）測(cè)定VEGF-C、LYVE-1 表達(dá)水平。LYVE-1 和 VEGF-C石蠟切片分別采檸檬酸緩沖液以及EDTA 緩沖液進(jìn)行高溫修復(fù)。DAB 顯色，蘇木精復(fù)染。

1.3 結(jié)果判定

（1）VEGF-C 蛋白表達(dá)判定。采用Mattern法，結(jié)合細(xì)胞染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞所占面積進(jìn)行積分判定。根據(jù)染色強(qiáng)度，賦分分別為：不染色（0分）、輕度染色（1 分）、中度染色（2 分）、強(qiáng)染色（3分）。根據(jù)染色面積，賦分分別為：無(wú)細(xì)胞染色（0分）、＜25%細(xì)胞染色（1 分）、25%～50%細(xì)胞染色（2 分）、＞50%細(xì)胞染色（3 分）。兩種積分之和＞2 分者定為表達(dá)陽(yáng)性；≤2 定為表達(dá)陰性。（2）LMVD 計(jì)數(shù)采用Wendner 方法進(jìn)行。在低倍鏡下對(duì)整個(gè)切片進(jìn)行分析，尋找淋巴血管密集。接著在高倍鏡下對(duì)染色的淋巴血管計(jì)數(shù)。4 個(gè)視野平均值即為L(zhǎng)MVD。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0 進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料進(jìn)行x2檢驗(yàn)，計(jì)量資料比較采用t 檢驗(yàn)，P ＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF-C、LYVE-1在病變組織的表達(dá)情況

HE 染色示：病變組VEGF-C 蛋白表達(dá)陽(yáng)性45 例，陽(yáng)性率為77.59%（45/58），良性組陽(yáng)性率為25.00%（3/12），兩組VEGF-C 陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。兩組LYVE-1 在組織中均呈陽(yáng)性。病變組LMVD 較肺良性組明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.672，P ＜0.05）。見(jiàn)表1、圖1。

表1 NSCLC組織與肺良性病變組織LMVD比較

圖1 VEGF 在NSCLC 組織中的表達(dá)（免疫組化×100）

2.2 VEGF-C表達(dá)與LYVE-1 標(biāo)記淋巴管密度的關(guān)系

VEGF-C 表 達(dá) 陽(yáng) 性 組 織LMVD 為（12.73±2.41）個(gè)/HP×200，顯著高于陰性組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.748，P ＜0.05）。Pearson 相關(guān)分析表明VEGF-C 陽(yáng)性表達(dá)與LMVD 有顯著相關(guān)性（r=0.734，P ＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 VEGF-C蛋白表達(dá)與淋巴管密度的關(guān)系

2.3 VEGF-C表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PTNM 分期的關(guān)系

有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NSCLC 患者VEGF-C 陽(yáng)性率為96.00%，PTNM Ⅲ+Ⅳ期陽(yáng)性率為100.00%，顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者和PTNM Ⅰ+Ⅱ期者（x2=8.567、11.011，P ＜0.05）。Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果表明：VEGF-C 陽(yáng)性率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和PTNM 分期有顯著相關(guān)性（r=0.769、0.745，P ＜0.05）。見(jiàn)表3。

3 討論

NSCLC 患者預(yù)后較差，復(fù)發(fā)率較高[5]。近年來(lái)的研究已經(jīng)表明：淋巴管轉(zhuǎn)移可能是導(dǎo)致NSCLC復(fù)發(fā)率較高的主要原因[6-8]。淋巴管生成因子可以調(diào)控淋巴管生成。淋巴管VEGF-C 與受體結(jié)合后，可以激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)淋巴管生成[9]。一般情況下，VEGF-C 在人體的表達(dá)是受抑制的。但是在病理狀態(tài)下，腫瘤細(xì)胞可以大量分泌VEGF-C，并誘導(dǎo)腫瘤淋巴管形成和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[10-11]。因此，探討VEGF-C 與微血管密度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系對(duì)于更好的認(rèn)識(shí)NSCLC、預(yù)防NSCLC 復(fù)發(fā)具有重要的臨床意義。從本研究的結(jié)果來(lái)看，相比于良性病變者，NSCLC 患者VEGF-C 陽(yáng)性率更高，是良性組的3 倍。研究結(jié)果與多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)論是一致的[12-13]。該結(jié)果表明VEGF-C 與NSCLC 的進(jìn)展存在密切的關(guān)系。

表3 VEGF-C表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PTNM 分期的關(guān)系[n（%）]

LYVE-1 是一種由322 個(gè)氨基酸組成的膜蛋白[14]。由于該蛋白在正常組織和病變組織中均呈陽(yáng)性，因此可以用作腫瘤組織淋巴血管的特異性標(biāo)記物。在本組資料中，良性組和病變組LYVE-1 均為陽(yáng)性表達(dá)，也證實(shí)了LYVE-1 的特異標(biāo)記價(jià)值。從LMVD 比較來(lái)看，病變組中VEGF-C 表達(dá)陽(yáng)性組織的LMVD 為（12.73±2.41）個(gè)/HP×200，顯著高于陰性組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.748，P ＜0.05）。Pearson 相關(guān)分析表明VEGF-C 陽(yáng)性表達(dá)與LMVD有顯著相關(guān)性（r=0.734，P ＜0.05）。這一結(jié)果VEGF-C與淋巴管形成及轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系。關(guān)于VEGF-C與淋巴管形成和轉(zhuǎn)移的關(guān)系，R.P.Hulse 等[10]認(rèn)為淋巴管的通透性更強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞可以從內(nèi)皮細(xì)胞間隙更方便的進(jìn)入淋巴管，并導(dǎo)致NSCLC 復(fù)發(fā)。他們的意見(jiàn)是VEGF-C 高表達(dá)，讓淋巴管增多，為腫瘤進(jìn)展和復(fù)發(fā)提供了條件。過(guò)江等[11]則認(rèn)為VEGF-C 本身是一種趨化因子，具有活化淋巴管、誘導(dǎo)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞分泌趨化因子及類似物的作用，可以讓腫瘤細(xì)胞通過(guò)間質(zhì)液被動(dòng)進(jìn)入淋巴管，并出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。雖然學(xué)者們關(guān)于VEGF-C 高表達(dá)與淋巴管形成和轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制存在一定的不同，但是都認(rèn)為VEGF-C 的高表達(dá)為淋巴管形成和轉(zhuǎn)移提供了“動(dòng)力”[1，5，14-16]。本研究還探討了VEGF-C 表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期的相關(guān)性。從結(jié)果來(lái)看，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期惡性程度越嚴(yán)重NSCLC 患者更容易出現(xiàn)VEGF-C 高表達(dá)。VEGF-C 與TNM 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有顯著的相關(guān)性。上述結(jié)果表明對(duì)于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM 分期越嚴(yán)重的患者，在治療中更要注意術(shù)后NSCLC 的復(fù)發(fā)。

綜合本研究的結(jié)果，VEGF-C 與淋巴管形成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系，可以調(diào)節(jié)腫瘤淋巴管形成和轉(zhuǎn)移。基于本研究結(jié)果，抑制VEGF-C 分泌或阻斷VEGF-C 合成信號(hào)，可以有效的改善NSCLC患者治療和預(yù)后，有必要進(jìn)一步深入探討VEGF-C在NSCLC 進(jìn)展、復(fù)發(fā)以及治療和預(yù)后的價(jià)值。

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