棉花GhWRKY4a基因的分離及表達分析

王存興,王琛,趙光棟

1.濟寧高級職業(yè)學校,山東濟寧272100

2.山東農業(yè)大學生命科學學院,山東泰安271018

棉花GhWRKY4a基因的分離及表達分析

王存興1,王琛2,趙光棟2

1.濟寧高級職業(yè)學校,山東濟寧272100

2.山東農業(yè)大學生命科學學院,山東泰安271018

WRKY轉錄因子是主要存在于植物中的一類轉錄因子，在植物的衰老、生長發(fā)育、生物和非生物脅迫應答等過程中起著重要的調控作用。本研究通過電子克隆結合RT-PCR技術從陸地棉（Gossypium hirsutum）中分離得到一個GhWRKY4a基因。序列分析表明，該基因開放閱讀框1539 bp，編碼512個氨基酸，其預測蛋白含有一個WRKY結構域和C2H2型鋅指結構，屬于典型的Ⅱ類b族WRKY基因。亞細胞定位分析顯示，GhWRKY4a特異性的定位在細胞核中。此外，利用PlantCare數(shù)據(jù)庫預測該基因啟動子含有多個生物與非生物脅迫響應、光應答和生長發(fā)育相關的順勢作用元件。利用qRT-PCR方法研究GhWRKY4a基因在轉錄水平的表達特性，結果表明該基因的表達受到多種生物和非生物脅迫的影響。由此推測，GhWRKY4a可能參與了復雜的植物信號途徑并在植物的抗逆反應中發(fā)揮了重要的作用。

棉花;基因克隆;GhWRKY4a;表達分析

由于植物的固著屬性及自然界的環(huán)境變化，植物時刻遭受著各種生物和非生物的脅迫，如病蟲害、干旱、低溫、高鹽等。為了適應多變的環(huán)境條件，植物在進化過程中形成了一系列調節(jié)機制。研究結果表明，轉錄因子在這一系列的調控中具有重要作用[1,2]，有關高等植物轉錄因子編碼基因的結構和功能及其在植物改良中的應用研究，已成為植物基因表達調控領域的熱門課題，尤其是擬南芥基因組測序完成后，對其轉錄因子的研究更為突出[3]。其中WRKY轉錄因子家族是近年來研究較廣泛的一類重要的轉錄因子。

WRKY蛋白是主要存在于植物中的轉錄調節(jié)因子。自從它的第一個家族成員在甘薯中被發(fā)現(xiàn)后[4]，WRKY轉錄因子逐漸成為人們研究的熱點，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa）中分別分離了74和109個WRKY基因[5]，雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）和陸地棉（Gossypium hirsutum）中分別得到116和103個WRKY基因[6]。WRKY轉錄因子含有一個或兩個保守的、約60個氨基酸的DNA結合結構域（被稱為WRKY結構域）。WRKY結構域N端為高度保守的氨基酸序列（WRKYGQK），因此命名為WRKY轉錄因子；C端為鋅指結構（C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H型或C-X7-C-X23-H-X1-C型）[7]。WRKY結構域能夠通過與核心序列為（T）（T）TGAC（T/C）的W-box順式元件特異結合而調節(jié)基因的表達[8]。根據(jù)WRKY結構域的數(shù)量和鋅指結構的特點，可將WRKY轉錄因子家族分為三大類（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ）。根據(jù)額外的保守結構，II類WRKY轉錄因子進一步分為IIa、IIb、IIc、IId和IIe五個亞族[9]。

WRKY基因在植物體內并非組成型表達，而是受生物脅迫、各種環(huán)境因子（干旱、低溫、高溫、高鹽、機械脅迫等）和信號分子的誘導表達。例如，在辣椒（Capsicum annuum）中，CaWRKY27作為一個正調節(jié)因子通過SA、JA/ET介導的信號途徑提高了轉基因煙草對青枯菌（R.solanacearum）的抗性[10]。煙草用煙草花葉病毒（TMV）或者細菌進行感染，再或者使用真菌誘導、水楊酸（SA）以及H2O2處理后，將強烈誘導WRKY基因的超量表達[11-13]。在擬南芥中，49/72的被測試WRKY基因均對細菌感染和SA處理做出了快速反應[14]。非生物脅迫如創(chuàng)傷、干旱、低溫的適應性、熱誘導的驟冷耐受性也會引發(fā)WRKY基因在植物中的表達[15-17]。大量研究表明，WRKY類家族基因在植物的抗逆性方面起著重要的作用。

WRKY轉錄因子作為植物應對外界生物與非生物脅迫中重要的響應蛋白，已經(jīng)越來越多的引起了人們的關注。因此，闡明WRKY轉錄因子在防御網(wǎng)絡中調控與作用機理，對于培育抗逆作物品種具有重要的理論與實踐意義。棉花是一種非常重要的纖維和油料作物，其產量和品質常常受到各種復雜環(huán)境的影響，本研究我們從陸地棉（Gossypium hirsutum）中分離出一個典型的II類b族的WRKY基因，命名為GhWRKY4a，并分析了棉花在受到各種生物脅迫和非生物脅迫后GhWRKY4a的響應特性。研究發(fā)現(xiàn)，病原菌及多種抗病相關激素可以影響GhWRKY4a基因的表達，GhWRKY4a可能參與復雜的信號傳導途徑，并在激素介導的植物的抗病反應中起重要作用。本實驗為進一步研究該基因在棉花抗病反應中的作用奠定了理論基礎，并為棉花基因工程育種提供新的基因資源。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 植物材料供試材料陸地棉（Gossypium hirsutum）魯棉22為本實驗室保存。

1.1.2 菌株與質粒本研究所用的克隆載體pEASY-T1 simple購于Transgen公司，大腸桿菌菌種Escherichia coli（DH5α）為本實驗室保存。

1.1.3 酶及生化試劑RNA反轉錄試劑盒為康為世紀公司產品，cDNA純化試劑盒Wizard DNA Clean-up System購自Promega公司，質粒提取試劑盒Plasmid Mini Kit購自OMEGA公司，膠回收試劑盒購自索萊寶公司。CTAB、DEPC、Tris、β-巰基乙醇等化學試劑均購于Sigma公司。

1.1.4 PCR引物PCR引物（表1）由上海生物工程公司合成。

表1 本實驗所用的引物序列Table 1 The primers used in this study

1.2 棉花材料處理

棉花種子經(jīng)自來水沖洗后用濕潤的紗網(wǎng)包住置于25℃培養(yǎng)箱中避光催芽萌發(fā)，萌發(fā)的棉花種子去殼后擺放到紗網(wǎng)上于光照培養(yǎng)箱中水培，相對濕度60～75%，光照強度1500 Lux，光照條件為16 h光照/8 h黑暗。對子葉期幼苗（約萌發(fā)后的第7 d），進行如下脅迫處理：

（1）非生物脅迫處理：

200 mM/L NaCl處理0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h；用200 mM NaCl的水培幼苗。

15%PEG6000處理0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h；用濃度為15%的PEG6000（w/v）水培幼苗。

（2）信號分子處理：

10 mmol/L SA處理0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h；噴灑葉片。

100 μM/L MeJA處理0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h；噴灑葉片。

5 mmol/L ET處理0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h；噴灑乙烯利于葉片。

10 mmol/L H2O2處理0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h；噴灑葉片。

（3）用青枯病菌、立枯病菌的懸浮液滴灌法接種根，處理時間段為1 d，2 d，3 d，4 d，5 d。清水作對照。在不同的處理時間分別取子葉置于液氮中冷凍，-80°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNA的提取，cDNA的合成和DNA的分離

RNA的提取根據(jù)TaKaRa公司的TRIzol試劑盒說明書進行，RNA提取物經(jīng)過不含RNA酶的DNaseI（Promega公司）純化后，用康為世紀公司的反轉錄試劑盒合成cDNA。DNA的提取根據(jù)CTAB法進行[18]。

1.4 GhWRKY4a CDS全長的克隆

根據(jù)雷蒙德氏棉基因組數(shù)據(jù)庫，設計特異性引物WRKY-5和WRKY-3，以cDNA為模板進行PCR，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。將獲得的目的片段回收后連接到克隆載體pEASY-T1 simple上，然后轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，在含Amp的LB固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)過夜后，挑取單菌落，于600 μLLB（Amp）液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)3 h后進行菌液PCR鑒定。將鑒定好的菌液寄往上海生物工程公司測序。

1.5 GhWRKY4a基因組全長及啟動子序列的克隆

利用特異性引物WRKY-5和WRKY-3，以棉花DNA為模板進行PCR，并將獲得的目的片段回收后連接到克隆載體pEASY-T1 simple上，轉入大腸桿菌感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆后送上海生物工程公司進行測序，得到GhWRKY4a的基因組全長序列。

設計特異性引物WRKY-Q-5和WRKY-Q-3，以棉花DNA為模板進行PCR，PCR產物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，切下目的條帶后與克隆載體pEASY-T1 simple相連，篩選陽性克隆后送上海生物工程公司測序得到GhWRKY4a的啟動子序列。

1.6 亞細胞定位分析

利用引物WRKY-L-F（含XbaI酶切位點）和WRKY-L-R（含KpnI酶切位點）來擴增GhWRKY4a全長cDNA片段，并將目的片段與pEASY-T1 simple載體連接，選擇陽性克隆送上海生物工程公司測序。測序正確后，利用XbaI和KpnI進行雙酶切，將目的片段與PBI121-GFP質粒連接構建重組質粒。通過基因槍注射，將重組質粒轉入洋蔥表皮細胞中，利用熒光顯微鏡觀察綠色熒光并拍照。

1.7 GhWRKY4a基因的表達模式分析

以GhUBI基因為內參基因，利用qRT-PCR分析GhWRKY4a基因的表達模式。RNA的提取和cDNA的合成與上述方法相同。qRT-PCR所用的SYBR Premix Ex Taq購自TaRaKa公司，熒光定量PCR儀CFX96TMReal-time Detection System購自Bio-Rad公司。

1.8 生物信息學分析

利用NCBI網(wǎng)站的BLAST(http://www.ncbi.nlm.gov/blast)和DNAman software 5.2.2進行同源序列比對和分析；用MEGA4.1構建系統(tǒng)進化樹；用PSORT程序進行蛋白預測。利用PlantCare（bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）數(shù)據(jù)庫分析啟動子序列。

2 結果與分析

2.1 GhWRKY4a基因的分離

利用特異性引物WRKY-5和WRKY-3，以棉花總RNA的反轉錄產物為模板進行PCR，擴增得到一條約1600 bp的條帶。測序鑒定后，利用DNAman software 5.2.2對序列進行分析，該序列與雷蒙德氏棉基因組數(shù)據(jù)庫中的Cotton-D_gene-10023049基因的同源性為98%，初步證明該PCR片段為所要克隆的棉花目的基因，命名為GhWRKY4a。該序列包含1539 bp的開放閱讀框，編碼512個氨基酸殘基，預測蛋白質的分子質量為55.04 kDa（圖1）。

圖1 GhWRKY4a全長CDS序列及其推導的氨基酸序列WRKYGQK序列、翻譯起始密碼子（ATG）與終止密碼子（TAG）用方框標出Fig.1 Nucleotide sequences of CDS and deduced sequence of amino acid residues of GhWRKY4aWRJKYGQK sequence,translation initiation codon(ATG)and termination codon(TAG)were marked in box

圖2 GhWRKY4a與其他WRKY蛋白序列的同源性比較相同的氨基酸用黑色陰影標出;60個氨基酸殘基的WRKY結構域用箭頭標出;WRKYGQK序列用方框標出Fig.2 Comparison of homology between GhWRKY4a and other WRKYprotein sequenceThe same amino acids were shaded in black. The WRKY structure domains of 60 amino acids were indicated with arrows. WRJKYGQK sequence was marked in box

2.2 GhWRKY4a蛋白序列分析

同源蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)，GhWRKY4a蛋白在284～290位氨基酸殘基為一個典型的WRKY結構域（圖2），是WRKY的典型特征。該WRKY結構域由60個氨基酸殘基組成，包含一個保守的WRKYGQK氨基酸序列和一個C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H型鋅指結構（圖2）。這些結構特征表明所得基因確實為第II亞族的WRKY成員。通過雷蒙德氏棉基因組數(shù)據(jù)庫和TAIR網(wǎng)站查到一些已知分類的WRKY基因，利用MEGA4.1軟件對這些WRKY蛋白進行聚類分析，構建了同源進化樹。聚類分析表明WRKY蛋白分為三類（第I、II、III族），其中第II族可進一步分為五個亞族（IIa、IIb、IIc、IId和IIe）。GhWRKY4a與IIb亞族的WRKY成員進化關系密切，包括AtWRKY42、GrWRKY4（圖3）。由進化樹可以看出，GhWRKY4a屬于IIb亞族。WRKY類轉錄因子在進化上的多樣性，也預示了其功能的多樣性，而且不同物種的同一個亞族的成員間可能在功能上具有相似性。

圖3 GhWRKY4a蛋白序列與雷蒙德氏棉、擬南芥WRKY蛋白質序列的聚類分析GhWRKY4a用方框標出Fig.3 Dendrogram of cluster analysis on GhWRKY4a protein and Gossypium raimondii and Arabidopsis WRKY proteins sequenceGhWRKY4a was marked in box

2.3 GhWRKY4a基因組序列分析

根據(jù)已獲得的GhWRKY4a基因cDNA全長序列設計了一對特異性引物（WRKY-Q-F和WRKY-Q-R），以棉花基因組DNA為模板，進行PCR擴增，得到長度為1888 bp的片段。將GhWRKY4a的DNA序列與CDS序列進行比較后，發(fā)現(xiàn)該基因共含有4個內含子（圖4）。并且這4個內含子都具有植物內含子的典型特征：富含AT；在5′和3′端的剪切位點均含有保守的5′-GT和AG-3′序列。

圖4 GhWRKY4aDNA結構示意圖灰色方塊代表外顯子，直線代表內含子Fig.4 Schematic representation of the DNA structure of GhWRKY4aGrey boxes indicated exons,and lines indicated introns

2.4 GhWRKY4a基因的啟動子序列分析

利用雷蒙德氏棉基因組數(shù)據(jù)庫，設計特異性引物WRKY-Q-F和WRKY-Q-R，克隆得到1098 bp的啟動子序列。用PlantCare軟件分析預測后發(fā)現(xiàn)，在該啟動子中，包含多種脅迫相關的應答元件，部分預測的順式作用原件序列及位置如圖5。該序列中存在典型的TATA-box和CAAT-box。除此之外，這該區(qū)域中還存在非生物脅迫應答元件（如CGTCA-motif（響應信號分子MeJA），ERE（響應信號分子ethylene），TC-rich repeats（脅迫和防御反應元件），以及與干旱脅迫有關的MBS元件等），生物脅迫應答元件，光響應元件及生長發(fā)育相關的元件。預測結果表明，GhWRKY4a可能與植物的生物和非生物脅迫應答和生長發(fā)育相關。

圖5 GhWRKY4a啟動子部分作用元件Fig.5 Functional partial elements of the promoter of GhWRKY4a

2.5 亞細胞定位分析

運用在線分析軟件PSORT，預測GhWRKY4a蛋白定位在細胞核。為了進一步確認GhWRKY4a蛋白在細胞內的亞細胞定位，將CaMV35S啟動子與GhWRKY4a連接構建了pBI121-GhWRKY4a-GFP表達載體，35S::GFP作對照（圖6-A）。然后用基因槍法將重組質粒和空載體轉化入洋蔥表皮細胞使其瞬時表達，經(jīng)DAPI染色觀察細胞核后，利用GFP發(fā)射的熒光觀察GhWRKY4a的定位。如圖6-B所示，含有GhWRKY4a-GFP融合蛋白在洋蔥表皮中瞬時表達定位在細胞核，對照35S-GFP質粒轉化洋蔥表皮后起GFP熒光信號在細胞質和細胞核中都有表達，通過此結果可以推斷GhWRKY4a定位于細胞核內。該實驗結果與軟件預測一致。

圖6 GhWRKY4a::GFP融合蛋白的亞細胞定位（A）35S-GhWRKY4a::GFP和35S-GFP載體構建圖;（B）35S-GFP和35S-GhWRKY4a::GFP在洋蔥表皮中的瞬時表達。基因槍轟擊洋蔥表皮后12 h通過熒光顯微鏡進行觀察Fig.6 Subcellular localization of GhWRKY4a::GFPfusion protein(A) Schematic representation of 35S-GhWRKY4a::GFP fusion construct and 35S-GFP construct. (B) Transient expression of the 35S-GhWRKY4a::GFP and 35S-GFPconstructs in onion epidermal cells. The cells were viewed by confocal laser scanning microscope at 12 h after particle bombardment.

2.6 GhWRKY4a基因的表達模式分析

通過對GhWRKY4a啟動子序列的預測分析，可以推測GhWRKY4a可能參與到植物的脅迫應答過程中。為進一步研究GhWRKY4a的功能，我們通過實時熒光定量PCR的方法，檢測了GhWRKY4a在生物脅迫、非生物脅迫及外源植物激素的作用下的表達特性。越來越多的研究證明WRKY家族參與植物的非生物脅迫應答反應，為了探究GhWRKY4a是否參與了非生物脅迫應答，我們對棉花進行了干旱（PEG），高鹽（NaCl）處理。由圖7-B可以看出，干旱處理后，GhWRKY4a的表達量從2 h開始增加，8 h達到最大值。而NaCl處理后，該基因的表達沒有明顯的變化（圖7-A）。

為了探討GhWRKY4a在棉花應對生物脅迫中的作用，我們給棉花幼苗接種了棉立枯（R.solani）和青枯勞爾氏菌（R.solanacearum）。結果如圖7-G所示，在接種棉立枯后，GhWRKY4a表達明顯受到抑制，接種第二天開始基因表達量明顯提高但都低于對照組。在接種青枯勞爾氏菌后，GhWRKY4a的表達量同樣顯著下降（圖7-H）。因此，我們推測GhWRKY4a可能參與病原信號轉導途徑。

植物激素以信號分子的形式參與到植物復雜的信號途徑中，SA、JA、ET和H2O2等作為重要的信號分子在調解下游防衛(wèi)基因和植物應對生物和非生物脅迫的應答反應中發(fā)揮著不可或缺的作用[19-20]。為了研究GhWRKY4a在信號轉導中的作用，我們檢測了該基因在SA，ET，MeJA和H2O2誘導條件下的表達特性。由圖7可以看出，SA，ET，MeJA和H2O2均能顯著抑制該基因的表達。根據(jù)這些結果推斷GhWRKY4a可能參與復雜的信號傳導途徑，并在激素介導的植物的抗病反應中起重要作用。

圖6 GhWRKY4a在不同處理條件的表達模式分析Fig.6 Expression patterns analysis of GhWRKY4a under different treated conditions

3 討論

隨著基因分子生物學研究的不斷深入，越來越多的WRKY家族轉錄因子被克隆。WRKY轉錄因子作為植物應對外界生物與非生物脅迫中重要的響應蛋白已經(jīng)引起人們越來越多的關注。WRKY基因家族除了在植物抗逆信號轉導方面發(fā)揮著重要作用以外，在調控植物生長發(fā)育方面也具有非常重要的作用，包括葉片的衰老、種子形成、休眠、萌發(fā)、果實的成熟、根毛發(fā)育、胚胎形成等過程。目前WRKY轉錄因子在植物體內尤其是在模式植物水稻和擬南芥中的生物學功能得到了廣泛的研究和闡明，但是關于棉花WRKY基因的結構和功能研究非常少。棉花是一種重要的經(jīng)濟作物，其產量常常受到各種復雜環(huán)境的影響，為探究棉花WRKY轉錄因子的功能，我們以棉花為研究對象，分離了一個IIb亞族WRKY基因，命名為GhWRKY4a，并對其表達特性及生物學功能進行了初步探討。

蛋白序列分析及聚類分析發(fā)現(xiàn)轉錄因子GhWRKY4a具有典型的WRKY結構域，是WRKY基因Ⅱ類b族的成員之一。亞細胞定位進一步證明了GhWRKY4a定位于細胞核內，這就意味著GhWRKY4a與其他的WRKY轉錄因子一樣是在細胞核中發(fā)揮作用的。這與轉錄因子主要在細胞核中行使其功能的特征一致。

為了深入了解GhWRKY4a的功能，我們克隆了這個基因的部分啟動子序列并對該序列進行了預測分析，發(fā)現(xiàn)該啟動子序列中除了含有啟動子的核心序列TATA-box，CAAT-box，還發(fā)現(xiàn)了信號分子應答元件、光應答元件、非生物脅迫應答元件、胚乳發(fā)育相關的元件等。對啟動子序列的分析將有助于更進一步的了解基因的功能。GhWRKY4a基因在轉錄水平的表達特性分析進一步表明，該基因的表達受到多種生物和非生物脅迫的影響。推測GhWRKY4a可能參與復雜的信號傳導途徑，并在植物的抗逆反應中起重要作用。

在抗病應答過程中，植物激活體內一系列的信號途徑，這些信號途徑中許多抗病相關基因能夠被激活表達。SA、JA、ET是抗病反應中關鍵的信號分子。SA介導的信號途徑一般與活體營養(yǎng)型病菌激發(fā)的抗病反應相關；而JA/ET介導的信號途徑一般與壞死營養(yǎng)型病菌或者昆蟲侵染激發(fā)的抗病反應相關[21]。這兩種信號途徑通過相互拮抗或者協(xié)同作用共同影響著植物抗病反應的結果。SA和H2O2是植物防衛(wèi)反應中兩種非常重要的信號分子，植物本身系統(tǒng)獲得性抗性（System acquired resistance,SAR）就是SA介導的。H2O2作為第二信使能夠自由穿越細胞膜直接行使胞間信號轉導功能，在植物的防衛(wèi)反應中起重要作用。另外，當植物受到環(huán)境脅迫時，體內活性氧（ROS）會迅速增加，從而激活相關基因的表達，H2O2是ROS的組分之一。對GhWRKY4a在多種信號分子脅迫下的表達特性進行了分析，結果表明，GhWRKY4a的表達可以被SA、MeJA、ET和H2O2所抑制。由此推測GhWRKY4a可能參與SA信號途徑及JA/ET介導的抗病信號途徑。

綜上所述，GhWRKY4a應答于多種信號分子、非生物脅迫和病原菌脅迫，由此我們推測，該基因可能參與棉花的抗病反應，本研究為進一步探明該基因在棉花防衛(wèi)反應中的作用奠定了基礎。

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IsolationandExpressionAnalysisofGhWRKY4afromGossypiumhirsutum

WANG Cun-xing1,WANG Chen2,ZHAO Guang-dong2
1.Jining Senior Vocational School,Jining 272100,China
2.College of Life Science/Shandong Agricultural University,Taian 271018,China

WRKY transcription factors are a kind of transcription factors mainly existing in plants.It plays an important role in regulating plant senescence,growth,development and responses to various abiotic and biotic stresses.In this study,we isolated and characterized GhWRKY4a from cotton(Gossypium hirsutum)through the in silico cloning and RT-PCR.Sequence analysis revealed that the GhWRKY4a contained a complete open reading frame(ORF)of 1539 bp,which encoded 512 amino acids.The predicted protein contains a WRKY domain and a C2H2-type zinc finger motif,which belongs to typicalⅡb family.Subcellular localization analysis revealed that GhWRKY4a protein localized to the nucleus.In addition,various putative cis-acting elements involved in abiotic and biotic stress responses,light responses and development were predicted by the database search programs PlantCare.We analyzed the expression pattern at the level of transcription of GhWRKY4a by quantitative real-time PCR.The result showed that the expression of GhWRKY4a was influenced by various abiotic and biotic stresses.According to the results, we deduced that GhWRKY4a is regulated by an intricate network of signaling cascades and may play an important role in cotton defense responses.

Cotton;gene cloning;GhWRKY4a;expression analysis

S642.4

A

1000-2324(2015)05-0658-08

2014-04-11

2014-05-02

王存興(1959-),男,學士,高級講師,主要從事植物生物學教學與研究.E-mail:wangcx7818@sina.com