依諾沙星-銪絡合物為探針的熒光光度法測定肝素

苗延虹*,董光霞

山東農業大學化學院,山東泰安271000

依諾沙星-銪絡合物為探針的熒光光度法測定肝素

苗延虹*,董光霞

山東農業大學化學院,山東泰安271000

在pH值為7.40的HMT-HCl緩沖溶液中，銪（Eu3+）能和依諾沙星（Enoxacin）形成絡合物，發出Eu3+的特征熒光，最大激發和發射波長分別為330 nm和612 nm，狹縫均為5 nm，肝素的加入能使Eu3+的特征熒光顯著增強。在線性范圍0.117～5.85 μg·mL-1內，肝素的濃度和熒光強度成很好的線性關系，線性方程為△F=-5.691+6.98 c（r= 0.994）（c:μg·mL-1）；檢出限為0.06 μg·mL-1。本方法用于實際樣品的測定，靈敏度高、選擇性好、干擾少、操作簡單，結果令人滿意。

依諾沙星;銪;熒光光譜法;肝素

肝素具有廣泛的生物學功能,在人體內由肥大細胞分泌而自然存在于血液中，在體內外均有延緩或阻止血液凝固的作用，是心血管和血栓病人的首選抗凝血藥，可用于調血脂、抗血栓，改善血液流變學指標及免疫調節等，肝素或其衍生物還可廣泛應用于美容、化妝行業，是一種重要的生化藥物。肝素的檢測以化學方法為主，文獻報導有分光光度法[1-5]、共振瑞利散射法[6,7]、循環伏安法[8]、離子色譜法[9]、流動注射法[10]、高效液相色譜法[11]、熒光能量轉移法[12]。這些方法中，分光光度法雖然操作簡便、快速、儀器價廉，但線性范圍較窄，高效液相色譜法具有檢出限較低，線性范圍寬的優點，但操作繁瑣，儀器設備昂貴，電化學方法也不失為一種好的方法，但操作起來仍較復雜。

本文選擇依諾沙星作為銪離子的配體，研究了以肝素作為共配位體，與依諾沙星共同敏化銪離子特征熒光的可能性。實驗結果表明，依諾沙星-銪離子體系中銪離子位于612 nm處的特征熒光能夠被肝素顯著增強，且增強的熒光強度與一定范圍內肝素的濃度成正比，根據這一性質。本文以ENX-Eu3+作為熒光探針，建立了一種測定肝素的新方法。本方法與上述文獻報導的方法相比，靈敏度較高，選擇性好，干擾少，操作簡單，用于實際樣品的測定，結果令人滿意。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器pHS-3精密酸度計（上海自動化儀表有限公司），Cary Eclipse熒光分光光度計（美國VARIAN公司）。

1.1.2 試劑肝素鈉針劑：①天津健康藥業100606；②上海第一生化藥業100912；依諾沙星(中國藥品生物制品檢定所)貯備液濃度為1.0×10-3mol·L-1,工作液濃度為2.0×10-4mol·L-1，Eu3+貯備液濃度為2.0×10-2mol·L-1,工作液濃度為1.0×10-4mol·L-1；肝素鈉(中國藥品生物制品檢定所)貯備液濃度為1.17 mg·mL-1,工作液濃度為11.7μg·mL-1。HMT-HCl緩沖液（0.1 mol·L-1）：pH值為7.40。以上依諾沙星、肝素鈉儲備液與工作液均需置于0～4℃的生化培養箱內保存，所用試劑均為分析純，實驗用水為二次重蒸去離子水。

1.2 實驗方法

在10 mL比色管中依次加入1.7 mL 2.0×10-4mol·L-1ENX、1.0 mLpH=7.40的HMT-HCl緩沖溶液（0.1 mol·L-1）、0.5 mL1.0×10-4mol·L-1Eu3+和1.0 mL11.7μg·mL-1Hep，二次重蒸去離子水定容至10.0 mL,振蕩搖勻，10 min后,掃描熒光激發和發射光譜。在λex/λem=330 nm/612 nm處（激發和發射狹縫均為5 nm），用1 cm石英熒光液池,測定熒光強度F，同時測定試劑空白的熒光強度F0,△F=F-F0。

2 結果與討論

2.1 激發光譜和發射光譜

實驗條件濃度：ENX，3.4×10-5mol·L-1；Eu3+，0.5×10-5mol·L-1；Hep，1.17μg·mL-1；HMT-HCl，pH=7.40（0.1 mol·L-1）

按照實驗方法，分別掃描ENX、Eu3+、ENX-Eu3+和ENX-Eu3+-Hep溶液的激發和發射光譜(見圖1)。由圖1 a可知，ENX-Eu3+-Hep溶液有三個激發峰，其中301 nm處較強，但為了避免Eu3+的直接激發以及二級散射影響，選定330 nm為激發波長，發射光譜中，曲線1，ENX在416 nm處有一個很強的發射峰，曲線2，單純的Eu3+水溶液檢測不到Eu3+的特征熒光，比較曲線1和曲線3，可以看出，ENX在416 nm處的發射強度明顯降低，出現了591 nm和612 nm的Eu3+的特征熒光峰，分別對應于Eu3+的3D0-7F1，3D0-7F2能級躍遷。說明ENX和Eu3+生成了二元配合物并發生分子內能量轉移，使得Eu3+激發并發射特征熒光。曲線4由于肝素鈉的加入生成了Eu3+-ENX-Hep三元配合物,更有利于能量傳遞,使得熒光強度進一步增強。故實驗選取激發和發射波長分別為為330 nm和612 nm。

圖1 熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra1.ENX2.Eu3+3.ENX-Eu3+4.ENX-Eu3+-Hep

2.2 影響體系熒光強度的因素

2.2.1 酸度對體系熒光強度的影響在pH值為4.01～8.74范圍內考察了溶液的酸度對體系熒光強度的影響（圖2）。實驗結果表明：pH=7.17～7.60時，體系的熒光強度大而且比較穩定，因此選取pH=7.40進行下一步研究。

2.2.2 緩沖液種類及用量的影響實驗了以下緩沖溶液：NH3-NH4Cl、Tris-HCl、NaAc-HAc、HMT-HCl（pH值均調至7.40）對體系熒光強度的影響。結果表明：HMT-HCl緩沖體系對熒光增強效果最好。同時實驗了HMT-HCl緩沖液用量的影響，結果顯示：當緩沖液用量在0.8～1.2 mL時熒光較強。故選擇pH=7.40的HMT-HCl緩沖溶液1.0 mL，做進一步的研究。

2.2.3 依諾沙星與銪離子的濃度比對體系熒光強度的影響固定Eu3+濃度為0.5×10-5mol·L-1，對體系在ENX濃度不同時的熒光強度進行測定（圖3）。結果顯示：ENX與Eu3+濃度比為(6.5～7.5):1時，體系的熒光強度較大。故選擇Eu3+濃度為0.5×10-5mol·L-1(即濃度為1.0×10-4mol·L-1的Eu3+工作液加0.5 mL)，ENX濃度為3.4×10-5mol·L-1(即濃度為2.0×10-4mol·L-1的ENX工作液加1.7 mL)，即ENX與Eu3+濃度比為6.8:1做進一步的研究。

2.2.4 反應時間和加入順序的影響在最佳實驗條件下，考察了熒光強度隨時間的變化情況（圖4）。結果發現，當各反應組分混合后，體系的熒光強度受光照的影響較大,被熒光照射后體系變得不穩定。未經照射的體系在10 min～60 min內熒光值穩定。故選擇10 min后開始測定。當改變加樣順序時，按ENX、HMT-HCl緩沖液、Eu3+、Hep的順序加入時體系的熒光強度最大，加入穩定性也更好，穩定時間更長，故實驗中選擇這一加入順序。

圖2 pH值對Eu3+-ENX-Hep體系熒光強度F的影響Fig.2 The influence of pH on F of Eu3+-ENX-Hep system

圖3 依諾沙星和Eu3+的濃度對體系F的影響Fig.3 The influence of ENX and Eu3+concentration on F

圖4 反應時間對體系的熒光強度的影響Fig.4 The influence of reaction time on F

2.2.5 干擾物質對體系熒光強度的影響在最佳實驗條件下，當肝素鈉濃度為1.17μg·mL-1時，研究了一系列常見的干擾物質的影響，結果如表1所示。表中所列干擾物基本不干擾測定。

表1 干擾物質對體系熒光強度的影響Table 1 Effect of coexistent substances

2.3 工作曲線、線性范圍及檢出限

在最佳實驗條件下，繪制了肝素鈉濃度c（(g·mL-1）與△F之間的響應曲線,線性方程為△F=-5.691 +6.98c(μg·mL-1)，相關系數r=0.994，線性范圍0.117～5.85μg·mL-1。取11支10 mL的比色管按實驗方法配制空白溶液，測得s=0.02，檢出限為0.06μg·mL-1。

圖5 Hep工作曲線Fig.5 Working curve of Hep

3 肝素鈉樣品的測定

取兩支肝素鈉針劑（每支標示量為12500 IU/2 mL）：①天津健康藥業批號100606，②上海第一生化藥業批號100912，用二次重蒸去離子水稀釋至100 mL容量瓶中，再逐級稀釋至測定肝素的線性范圍，利用標準曲線法按實驗方法測定，結果如表2所示，同時按實驗方法測定效價，結果如表3所示。由表2和表3可以看出，此方法的回收率令人滿意，故此法可用于針劑中肝素的測定。

表2 肝素鈉樣品測定的回收率實驗(n=5)Table 2 Recovery test of the determination of heparin sodium in samples(n=5)

表3 肝素鈉針劑效價的測定(n=5)Table 3 Determination results of heparin in heparin sodium injection samples(n=5)

4 機理探討

Eu3+的配位數一般是8，而從實驗數據上可以看出Eu3+與ENX濃度比為1:6.8，故Eu3+是不飽和配位，配位化合物中剩余大量正電荷和空軌道。肝素作為一種生物大分子，在水溶液中以帶多個負電荷的大陰離子形式存在，可與配位化合物以靜電引力相互結合。同時肝素分子中含有硫酸根離子、羧基等基團，可同時參與配位。肝素的結構是由四糖單元所組成的聚合物，其四糖單元結構如圖6所示,每個四糖單元有3個-OSO3H基、2個-NHSO3H基和2個-COOH基。其中-OSO3H基和-NHSO3H基在上述實驗條件下能夠完全離解。羧基顯弱酸性且肝素中D-葡糖醛酸的pKa值為3.6，所以在上述實驗條件下羧基也能完全離解。實驗所用的肝素含有42個單糖單元,每個肝素四糖單元有7個結合位點(5個硫酸基和2個羧基)，所以每個肝素分子中總的結合位點數為73.5(42×7/4)。因此肝素鈉可以與ENX-Eu3+配合物以靜電作用和配位作用結合生成具有緊密結構的三元配合物。依諾沙星以及肝素共同作用的結果使銪離子位于612 nm處的特征熒光增強了數倍，且增強的熒光強度與肝素的加入量成正比。本文據此提出了一種以ENX-Eu3+作為熒光探針，測量肝素的新方法。該方法簡便易行，反應迅速,穩定性好，靈敏度高，用于測定肝素具有較好的線性范圍，用來測定針劑中肝素的含量，結果令人滿意。

圖6 肝素的四糖單元結構Fig.6 Structure of the tetrasaccharide unit of Hep

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Spectrofuorimetric Determination on Heparin Using Enoxacin-Europium Probe

MIAO Yan-hong*,DONG Guang-xia
College of Chemistry and Material Science/Shandong Agriculture University,Taian 271000,China

A new method for determination of Heparin by fluorometry method was established.In HMT-HCl buffer solution at pH 7.40,Eu3+formed complex with enoxacin,which emitted characteristic fluorescence of Eu3+with maximum excitation wavelength at 330 nm,maximum emission wavelength at 612 nm and slit width at 5 nm.Additional Heparin resulted in a remarkable increase in the Eu3+characteristic fluorescence.Within the range of 0.117～5.85 μg·mL-1,the concentration of Heparin had a linear relationship with the fluorescent intensity,with linear equation of△F=-5.691+6.98 c（r=0.994）（c: μg·mL-1）and detection limit of 0.06 μg·mL-1.This method generated high selectivity,high sensitivity and low disturbance, which had been applied to the determination of practical samples with satisfactory result.

Enoxacin;Europium;Spectrofluorimetric;Heparin

0657.31;Q524.6

A

1000-2324(2015)05-0648-04

2013-11-25

2014-01-20

苗延虹(1967-),女,副教授.E-mail:quguoqing@126.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:quguoqing@126.com