青霉菌固體發酵對三七藥材活性成分的影響

青霉菌固體發酵對三七藥材活性成分的影響

許文迪,閆炳雄,邱智東,王偉楠*

(長春中醫藥大學,長春 130117)

摘要：目的對三七藥材經青霉菌發酵之后的主要活性成分變化進行研究。方法利用青霉菌對三七藥材進行固體發酵，根據HPLC-Q-TOF-MS的檢測結果，對三七發酵產物的主要活性成分進行分析和指認，同時考察黃曲霉素和赭曲霉素等微生物毒素的含量。結果三七藥材經青霉菌發酵之后稀有皂苷含量顯著提高，未見黃曲霉素和赭曲霉素產生。結論青霉菌可以對三七藥材中皂苷類成分進行轉化，提高稀有皂苷含量，改變藥性，且未見明顯的微生物毒素產生，具有一定的使用安全性。

關鍵詞：青霉菌；三七；活性成分；液質聯用

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2015.06.009

中圖分類號：R284.2文獻標志碼：A

文章編號：2095-6258(2015)06-1123-02

基金項目：國家科技支撐計劃課題(2012BAI29B05)。

作者簡介：許文迪(1990-),女,碩士研究生，主要從事中藥藥劑學研究。

收稿日期:(2015-10-11)

*通信作者：王偉楠，博士，講師，電話-15500072857，電子信箱-cnweinanwang@163.com

Chemical changes of bioactive compounds in Panax notoginseng fermented by Penicillium sp.

XU Wendi, YAN Bingxiong, QIU Zhidong, WANG Weinan*

(Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China)

Abstract:ObjectiveThe chemical changes of bioactive compounds in Panax notoginseng fermented by Penicillium sp. were studied in this paper.MethodThe major components together with aflatoxins and ochratoxins of the fermented panax notoginseng were analyzed and determined by HPLC-Q-TOF-MS. ResultThe content of rare ginsenosides in the fermented panax notoginseng significantly increased while neither aflatoxins nor ochratoxins was detected. ConclusionThe accumulation of rare ginsenosides and enhancement in efficacy of panax notoginseng could be achieved by fermenting with Penicillium sp. without any obvious biotoxins. Hence this fermentation product was either beneficial or harmless.

Keywords:Penicillium sp.; Panax notoginseng; bioactive components; LC-MS

現代藥理研究[1-3]表明，三七具有活血、止血、保護心肌、降血糖、提高記憶力、滋補強壯、免疫調節等療效。三七總皂苷(PNS)是三七的主要生理活性成分，含量達6 %[4-7]。本課題組前期發現三七藥材自然貯存過程中，非常容易感染青霉。本實驗首先利用青霉菌對三七藥材進行發酵，然后采用LC-MS方法，對青霉菌發酵三七藥材過程中，主要活性成分的變化進行檢測，為指導三七藥材的開發和利用以及稀有皂苷的大規模生產提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料Agilent 1260高效液相 (Agilent Technologies, USA)、Agilent 6520 Q-TOF 質譜儀(Agilent Technologies, USA)；生物安全柜(Thermo scientific 1300 A2)；恒溫恒濕培養箱(金壇市天竟實驗儀器廠)。 青霉菌(CICC 2515)購于中國工業微生物菌種保藏管理中心，復蘇后先于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)上擴繁，積累到一定生物量后，4 ℃斜面保存，備用。1.2方法1.2.1三七藥材固體發酵三七藥材粉碎(過1號篩)，加入60 %(V/W)的蒸餾水，攪拌均勻，分裝于250 mL)廣口瓶中，放入高壓蒸汽滅菌器中保持溫度121 ℃，滅菌60 min，取出，自然冷卻至室溫，在生物安全柜中接種青霉菌適量，待接種完成后放入溫度為28 ℃，濕度65 %恒溫恒濕培養箱中，培養20 d，備用。1.2.2色譜條件色譜柱：Agilent ZORBAX SB-AQ (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫；檢測波長：203 nm；進樣量：10 μL。1.2.3方法學考察1.2.3.1精密度考察取同一供試品溶液，按1.2.2項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖，并計算共有峰與特征峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性，計算RSD值。結果表明共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于3 %，說明該方法精密度符合要求。1.2.3.2重復性考察取同一批次三七發酵產物樣品6分，依1.2.1項下方法制備供試品溶液，按1.2.2項下色譜條件測定，記錄色譜圖，并計算共有峰與特征峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果表明共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于3 %，說明該方法精密度符合要求。1.2.3.3穩定性考察取同一供試品溶液分別于制備后0、2、4、6、8、10 h按1.2.2項下色譜條件測定，記錄色譜圖，計算RSD值。結果表明共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于3 %，說明供試品溶液在10 h內穩定性良好。

2結果

2.1色譜峰歸屬三七藥材經青霉菌固體發酵后主要活性成分發生較大變化。根據分子量和結構裂解規律，推斷1-12號色譜峰均為皂苷類成分。對皂苷類成分的分子量、極性的大小及相對保留時間，進行歸納總結，將色譜峰1、2、3、6、8、9分別指認為三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd和Rh4；經過標準品對照，色譜峰4、5、10、11和12分別鑒定為Rh1、F1、F2、Rg3和CK；色譜峰7的m/z= 637.4451 [M-H]-，計算分子式為C36H62O9，是人參皂苷Rh1和F1的同分異構體，根據三七及其加工產品成分分析的文獻[8-9]報道，推測該化合物為Sanchinoside B1。2.2藥材及發酵產物皂苷含量變化三七藥材經過發酵后，原生苷R1、Rg1、Re以及Rb1的含量均有不同程度的降低，而極性較低的稀有皂苷含量均有大幅度的提高；通過液質聯用的定量模式，記錄不同色譜峰發酵前后的峰面積變化，結果表明：三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1經發酵后含量分別降低64.15 %、6.89 %、1.99 %、87.84 %；而人參皂苷Rd和F2分別提高161.20 %和372.35 %；同時，在青霉發酵后的三七中檢出了稀有皂苷F1、Sanchinoside B1、人參皂苷Rg3和人參皂苷CK。

3小結

通過上述實驗結果得出，青霉菌可以對三七藥材中皂苷類成分進行轉化，并提高稀有皂苷含量，使得到的發酵產物展現出較高的臨床應用價值和挖掘潛力，為指導三七藥材的開發和利用以及稀有皂苷的大規模生產提供理論依據。然而，利用提取離子模式(EIC)對特定分子量的黃曲霉素和赭曲霉素進行檢測，并未發現明顯的微生物毒素產生，推測可能是在三七藥材基質上生長抑制了青霉合成微生物毒素的能力，因此，利用青霉菌發酵三七，提高活性成分含量，改造藥材品質具有一定的可行性。

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