Logistic回歸和ROC曲線評價生物標志物組對大動脈粥樣硬化性腦梗死的診斷價值

吳丹紅　李　華　李　晨　蔣筠斐　鐘　萍

201999　上海交通大學醫學院附屬第三人民醫院神經內科(吳丹紅　李　華　李　晨)；上海交通大學醫學院附屬第三人民醫院檢驗科(蔣筠斐)；上海中醫藥大學附屬上海市中西醫結合醫院腦病科[鐘　萍(通信作者)]

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Logistic回歸和ROC曲線評價生物標志物組對大動脈粥樣硬化性腦梗死的診斷價值

吳丹紅李華李晨蔣筠斐鐘萍

201999上海交通大學醫學院附屬第三人民醫院神經內科(吳丹紅李華李晨)；上海交通大學醫學院附屬第三人民醫院檢驗科(蔣筠斐)；上海中醫藥大學附屬上海市中西醫結合醫院腦病科[鐘萍(通信作者)]

目前在缺血性腦卒中急性期仍然缺乏一種廣泛應用、快速和敏感的診斷實驗。在一些其他醫學急癥，基于血液生物標志物的診斷實驗已經成為常規。如肌鈣蛋白、肌酸激酶、腦鈉肽、D-二聚體在急性心肌梗死、心力衰竭、肺栓塞的早期診斷中發揮重要作用。既往有研究表明，多種血液生物學標志物(超敏C反應蛋白、脂蛋白相關磷脂酶A2、金屬基質蛋白酶-9等)水平在缺血性腦卒中急性期有不同程度的升高[1-3]，但是單一標志物的變化對缺血性腦卒中的診斷具有一定的局限性。在我國TOAST病因分型中的大動脈粥樣硬化性腦梗死是重要的亞型，因此本研究篩選與大動脈粥樣硬化性腦梗死相關的6項血液生物標志物形成生物標志物組[脂蛋白相關磷脂酶A2(Lipoprotein-associated Phospholipase A2，Lp-PLA2)、髓過氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)、金屬基質蛋白酶-9(Matrix Metalloproteinase-9,MMP-9)、超敏C反應蛋白(Hypersensitive C-reactive protein，Hs-CRP)、纖維蛋白原(Fibrinogen, FIB)、腦鈉肽(Brain natriuretic peptide，BNP)]，應用Logistic回歸分析與ROC曲線對其進行綜合評價，以探討生物標志物組對大動脈粥樣硬化性腦梗死急性期的診斷價值。

1資料與方法

1.1臨床資料隨機選取2011年1月～2012年12月在上海交通大學醫學院附屬第三人民醫院神經內科住院的大動脈粥樣硬化性腦梗死急性期患者88例，均為發病后48h內入院。所有病例均符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2010》診斷標準[4]，并經頭顱MRI檢查證實，經TOAST分型[5]為大動脈粥樣硬化性腦梗死。另設對照組88例，為同期來院就診的頭痛頭暈患者，年齡、性別與病例組匹配，臨床癥狀和頭顱MRI檢查均不支持急性缺血性卒中診斷。所有病例均排除腦血管畸形、急慢性心、肝、腎功不全、心律失常、惡性腫瘤、外傷、甲狀腺疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病和結締組織病等疾病。

1.2方法對大動脈粥樣硬化性腦梗死患者(發病至采血時間均<48 h)和對照者入院當天仔細詢問病史(起病時間、誘因、起病形式、病程進展等)，并進行詳細的體格檢查，記錄患者的年齡、性別、既往病史包括高血壓病、糖尿病、吸煙、飲酒史，同時記錄患者本次的發病時間。

1.2.1標本采集所有研究對象均于入院次日清晨6時靜息狀態下抽取空腹肘靜脈血8 mL置于3個真空采血管內:2 mL用EDTA-K2抗凝，即刻送檢，進行Hs-CRP及BNP水平檢測；2 mL用1∶9枸櫞酸鈉抗凝，以3000 r/min離心10 min后得到乏血小板血漿，進行FIB水平檢測；采血4 mL后30 min內于2～8 ℃、3 000 r/min離心15 min，分離上層血清，保存于-80 ℃冰箱保存備用，避免反復凍融，用于后續Lp-PLA2 、MMP-9、MPO水平檢測。

1.2.2生物標志物組水平檢測Hs-CRP：使用QUICKREAD GO反射比濁儀及配套試劑，反射比濁法檢測；BNP：使用BIOSITE免疫熒光儀及配套試劑，免疫熒光法檢測；FIB：使用SYSMEX CA-7000血凝儀及儀器配套試劑盒，免疫比濁法檢測。以上三個檢驗項目由本院檢驗科完成。Lp-PLA2、MMP-9、MPO：使用eBioscience公司試劑，整個實驗過程均嚴格參照試劑說明書要求進行。Lp-PLA2、MMP-9、MPO均采用ELISA雙抗體夾心法檢測，在終止反映后30 min內分別在波長540 nm、450 nm的酶標儀上讀取數值，繪制標準曲線，根據標準品的濃度及對應的吸光度(A)值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據樣品的A值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。

2結果

2.12組臨床資料及生物標志物的比較

符合納入標準的大動脈粥樣硬化性腦梗死急性期患者88例，其中男63例，女25例，年齡46～81歲，平均年齡(63.45±12.12)歲。對照組為同期入院非腦卒中患者88例，其中男54例，女34例，年齡44～80歲，平均年齡(63.15±12.23)歲。2組比較年齡(P=0.867)及性別(P=0.152)差異不明顯。病例組高血壓病發生率高于對照組(P<0.05)，病例組與對照組的糖尿病、吸煙、飲酒史發生率差異不明顯(P>0.05)(表1)。病例組Lp-PLA2、MPO、MMP-9、hs-CRP、FIB、BNP水平均明顯高于對照組(P<0.05)(表2)。

表1　病例組與對照組一般危險因素比較

表2　病例組與對照組生物學標志物比較

2.26種生物標志物的Logistic回歸分析

Logistic回歸分析顯示，6種生物標志物中與大動脈粥樣硬化性腦梗死急性期的診斷呈正相關的是Lp-PLA2、MPO 、MMP-9、BNP(P<0.05)，而CRP、FIB的相關性則不明顯(P>0.05)(表3)。

表3　6種生物標志物的Logistic回歸分析

2.3ROC曲線分析4種生物標志物單獨及聯合檢測對大動脈粥樣硬化性腦梗死急性期的診斷價值

4種生物標志物單獨檢測的曲線下面積(AUC )BNP>Lp-PLA>MMP-9>MPO，最大為0.813，聯合檢測(新變量Y)的AUC為0.901(表4及圖1)。

表4　單一生物標志物和聯合檢測新變量

圖1 新變量Y和4種生物標志物的ROC曲線

3討論

缺血性腦卒中是由于向大腦提供血液和營養物質的血管阻塞而突然發作的一種病理狀態，早期確診是采取合適治療措施的重要依據。目前，缺血性腦卒中的早期診斷主要依靠臨床評估及影像學評價，大多根據臨床疑似腦卒中癥狀結合CT排除顱內出血進行診斷，存在一定的局限性。一些非腦卒中疾病也可能出現類似腦卒中的神經功能缺損癥狀。CT對缺血性腦卒中敏感性低，在發病早期經常是正常的，即使在發病后期小病灶及后顱窩病灶往往仍不能顯示。MRI對缺血性腦卒中的敏感性更高，但在大多數醫院發病早期不能立即應用，許多醫院沒有MRI設備。因此，臨床需要一種快速、準確、便捷、低成本的檢測手段作為目前診斷方法的補充。

缺血性腦卒中后伴隨腦損傷及機體對腦卒中的應答，大量的分子釋放入血。興奮性神經傳遞、炎癥反應、血栓形成和其他一些生理過程都能使這些分子從受損的神經元和膠質細胞釋放出來。既往研究表明，多種血液生物學標志物與缺血性腦卒中尤其是動脈粥樣硬化性腦梗死有關。LP-PLA2主要由成熟的巨噬細胞和淋巴細胞合成分泌，作為一種新型炎癥標志物，參與了動脈粥樣斑塊形成的發生、發展、不穩定性及破裂的各個階段，導致并加速動脈粥樣硬化的發生、發展。鹿特丹(Rotterdam)前瞻性病例隊列研究發現LP-PLA2與腦梗死的發病密切相關[6]。動脈粥樣硬化社區(ARIC)研究顯示，Lp-PLA2水平在缺血性腦卒中患者中升高[1]。我們前期的研究也表明，LP-PLA2參與大動脈粥樣硬化性腦梗死的病理生理過程[7]。MPO是由中性粒細胞、單核細胞和某些組織的巨噬細胞分泌的含血紅素輔基的血紅素蛋白酶。MPO能通過產生自由基和多種反應性物質，促進動脈粥樣斑塊形成和不穩定性增加，加速動脈粥樣硬化進展，進而引起多種血管事件。研究發現，MPO缺陷的個體罹患心腦血管疾病的危險性明顯下降，MPO水平的升高可以預測血管事件的危險性[8-9]。MMP-9是一種屬于金屬蛋白酶家族的明膠酶，能消化細胞外基質并降解基底膜成分。MMP-9作為一種炎癥反應因子可在多種病理條件下被激活，如動脈粥樣硬化、多發性硬化、腫瘤生長和轉移。在腦卒中動物模型中MMP-9的表達與血腦屏障破壞、水腫形成和出血性轉化顯著相關。在腦卒中模型和臨床腦卒中患者均觀察到MMP-9水平升高[10-11]。Hs-CRP是一種急性時相反應蛋白，主要由炎性介質刺激肝細胞分泌，是炎癥和組織損傷時的非特異性敏感的炎癥標志物。其在正常人血清中含量極微，而當機體存在動脈粥樣硬化性病變時血CRP水平明顯升高。研究表明Hs-CRP與缺血性腦卒中的發生有關[12-13]。BNP主要由心房心室肌細胞合成，在中樞神經系統亦廣泛分布。以往研究提示BNP 可以作為診斷心力衰竭的敏感性指標，近來發現BNP也具有預測動脈粥樣硬化危險性的意義。臨床研究發現急性缺血性腦卒中患者血清BNP水平升高，且升高的程度與腦梗死病情輕重及預后相關[14]。FIB是由肝臟合成的具有凝血功能的蛋白質，是一種急性時相蛋白，參與凝血和血小板聚集，和動脈粥樣斑塊形成關系密切。研究發現升高的FIB水平與缺血性腦卒中風險增加和不良預后相關[15-16]。 本研究結果亦顯示病例組血Lp-PLA2、MPO 、MMP-9、hs-CRP、FIB、BNP水平較對照組明顯升高。

但是由于腦細胞的異質性、腦缺血級聯反應的復雜性以及血腦屏障的存在，目前沒有一種生物標記物可以單獨用于缺血性腦卒中的臨床診斷[17]。在急性心肌梗死的診斷中雖然肌鈣蛋白I及其復合物在心肌組織中具有較高的特異性，但是其在血液中出現的時間相對于肌紅蛋白這個具有較低特異性但高度敏感性的生物標志物顯得滯后。因此，由肌紅蛋白、肌鈣蛋白I及其復合物、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶形成的生物標志物組對急性心肌梗死的診斷具有了較高的敏感性。正是這種基于血清生物標志物組的評估廣泛應用于心肌梗死診斷，為急性缺血性腦卒中的診斷實驗提供了新的思路。本研究選用與動脈粥樣硬化性腦梗死相關的生物標志物Lp-PLA2、MPO 、MMP-9、hs-CRP、FIB、BNP，其中Lp-PLA2、MPO 、MMP9、CRP與動脈粥樣硬化炎癥機制有密切的關系，MMP9、BNP與腦梗死血腦屏障破壞有關，FIB與凝血纖溶相關。本研究將這些生物學標志物進行組合形成生物標志物組(Lp-PLA2、MPO 、MMP9、CRP、FIB、BNP)，進行Logeistic回歸分析顯示，Lp-PLA2、MPO 、MMP9、BNP與大動脈粥樣硬化性腦梗死呈正相關(P<0.05)。

受試者工作特征曲線 (receiver operating characteristic curve，簡稱ROC曲線)目前已成為廣泛應用于臨床診療和人群篩檢研究中，其能將某種檢測的靈敏度及特異性聯系起來，是一種全面的、科學的評價檢測項目的方法。ROC曲線越向左上偏，曲線下的面積越大，其識別能力也就是臨床準確性就越優秀，其臨床診斷價值越大。本研究通過多變量Logistic回歸分析篩選出與大動脈粥樣硬化性腦梗死密切相關的生物標志物Lp-PLA2、MPO 、MMP9、BNP，并產生新變量Y。通過繪制ROC曲線得到新變量Y診斷的ROC曲線下面積為0.901,新變量Y值比任何單一指標的面積要大(Lp-PLA2:0.778;MPO:0.667;MMP9:0.720;BNP:0.813)。可見，通過檢測標記物組可以將大動脈粥樣硬化性腦梗死診斷的特異性和敏感性都提高到90%以上。多變量模型ROC曲線下面積達到0.901，對診斷大動脈粥樣硬化性腦梗死有較高的敏感性和特異性。

本研究結果表明，多種生物標志物聯合檢測是提高缺血性腦卒中診斷試驗臨床價值的有效手段。但由于腦卒中的病程復雜性及腦組織結構的特殊性，腦卒中生物標志物的敏感性及特異性一直是腦卒中生物標志物研究所面臨的主要問題。對于具有臨床應用潛能的候選生物標志物還需要經過反復的臨床驗證，以達到為解決臨床實際問題服務的最終目的。

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(2015-02-12收稿)

【摘要】目的評估生物標志物組對大動脈粥樣硬化性腦梗死的診斷價值。方法88例大動脈粥樣硬化性腦梗死患者和88例對照者入選本研究，分別檢驗脂蛋白相關磷脂酶A2(Lp-PLA2)、髓過氧化物酶(MPO)、金屬基質蛋白酶-9(MMP-9)、超敏C反應蛋白(Hs-CRP)、纖維蛋白原(FIB)、腦鈉肽(BNP)，應用Logistic回歸和ROC曲線分析生物標志物組對大動脈粥樣硬化性腦梗死的診斷價值。結果Logistic回歸顯示Lp-PLA2、MPO 、MMP9、BNP與診斷大動脈粥樣硬化性腦梗死呈正相關(P<0.05)，多變量模型ROC曲線下面積達到0.901。結論生物標志物組(Lp-PLA2、MPO 、MMP9、BNP)對大動脈粥樣硬化性腦梗死急性期的診斷提供了重要的價值。

【關鍵詞】大動脈粥樣硬化性腦梗死脂蛋白相關磷脂酶A2髓過氧化物酶金屬基質蛋白酶-9腦鈉肽

【DOI】10.3969/j.issn.1007-0478.2015.04.004

The diagnostic value of a biomarker panel for large artery atherosclerotic stroke with Logistic regression and ROC curveWuDanhong，LiHua，LiChen，etal.DepartmentofNeurology，ShanghaiThirdPeople’sHospital,Schoolofmedicine,ShanghaiJiaoTongUniversity，Shanghai201999

【Abstract】ObjectiveThe diagnosis of acute ischemic stroke is limited by the lack of a widely available, rapid, and sensitive diagnostic test. The purpose of the current study was to observe blood biomarkers levels of patients with acute large artery atherosclerotic stroke, and assess whether a test using a panel of biomarkers might provide useful diagnostic information in the early evaluation of stoke.Methods88 patients with acute large artery atherosclerotic stroke and 88 patients without acute ischemic stroke were enrolled. Blood samples were assayed for lipoprotein-associated Phospholipase A2(Lp-PLA2), myeloperoxidase(MPO), matrix Metalloproteinase-9(MMP-9), hypersensitive C-reactive protein, fibrinogen(Hs-CRP),and brain natriuretic peptide(BNP).The logistic regression and ROC curve were used to evaluate the diagnostic value of a biomarker panel for large artery atherosclerotic stroke.ResultsThe logistic regression model demonstrated that a diagnostic test incorporating the value of Lp-PLA2, MPO, MMP9 and BNP into a composite score was sensitive for large artery atherosclerotic stroke. The area under the ROC curve was 0.901.Conclusionsthese results suggest that a biomarker panel(Lp-PLA2、MPO 、MMP9、BNP)may add important diagnostic information in the early evaluation of large artery atherosclerotic stroke.

【Key words】Large artery atherosclerotic strokeLipoprotein-associated Phospholipase A2MyeloperoxidaseMatrix Metalloproteinase-9Brain natriuretic peptide

【中圖分類號】R743

【文獻標識碼】A

【文章編號】1007-0478(2015)04-0207-04

基金項目：上海市衛計委科研課題(項目編號為201440332和2012-460)；上海市科委引導項目(項目編號為14411972000)