RT-PCR檢測非小細胞肺癌前哨淋巴結微轉移的臨床研究

陳曹陽　李　軍　陳　濤　周鴻敏

皮　勇1　王忠明1　陳　燕1

RT-PCR檢測非小細胞肺癌前哨淋巴結微轉移的臨床研究

陳曹陽1李軍2陳濤2周鴻敏2

皮勇1王忠明1陳燕1

隨著環境污染的加重和吸煙率的增加，肺癌已經成為我國居民首位死亡原因，占所有惡性腫瘤死亡的22.7%[1-3]。雖然外科技術水平不斷提高，術后輔助放化療、基因治療等治療手段不斷成熟，肺癌的近期治療效果較以前有了很大改善，但非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的遠期預后卻仍不盡人意。Ⅰ期(pN0)NSCLC行根治術后5年生存率僅60%～70%[4-5]，而術后兩年腫瘤復發率則達30%[6-7]。

研究顯示腫瘤復發與淋巴結微轉移未被檢出有關[8-11]，微轉移是指存在于外周血、淋巴道、骨髓等組織器官中，但尚未形成轉移性腫瘤結節，用常規影像診斷方法難以發現的一種轉移腫瘤細胞[12]。如果能提高淋巴結微轉移的檢出率，精確TNM分期，就能更加準確的制定下一步治療方案，從而減少腫瘤復發，延長患者的生存時間。研究報道前哨淋巴結定位活檢(sentinel lymph node mapping and biopsy, SLNB)聯合分子生物學檢測技術可提高淋巴結微轉移檢出率[13-14]。

本研究應用RT-PCR檢測CK19mRNA在NSCLC前哨淋巴結(sentinel lymph node, SLN)中的表達，探討RT-PCR檢測技術在NSCLC SLN微轉移診斷中的可行性及其臨床意義。

材料與方法

一、一般資料

收集2010年6月至2011年6月華中科技大學同濟醫院學院附屬同濟醫院心胸外科收治的24例Ⅰ期(cT1N0M0/cT2N0M0)肺癌患者手術中取得所有淋巴結標本，其中男16例，女8例，平均年齡56.4(41～62)歲。所有病例均符合下列條件：系原發腫瘤，無區域淋巴結轉移；腫瘤距隆突≥2 cm；頭部CT、腹部B超、骨ECT等檢查無腫瘤遠處轉移，肺功能、心電圖、血尿常規、肝腎功能等評估可行肺葉切除術；術前未行放化療。

二、研究方法

1. 標本采集：所有病例術中行SLNB，即探查病變情況確定可以手術切除后將4 ml亞甲藍注射于腫瘤周圍(前、后、左、右各1 ml)。3～5 min后觀察肺門及縱隔淋巴結有無藍染，有藍染者為SLN。然后行肺葉切除術及根據淋巴結藍染情況行淋巴結清掃術。所有淋巴結取出后用無菌生理鹽水清洗去除周圍脂肪組織，然后各枚淋巴結均分為兩半，一半送常規病理檢查，明確腫瘤病理類型、分化程度及是否有淋巴結轉移；另一半編號置于-80℃冰箱保存用于CK19mRNA檢測。

參照美國Louisville大學SLNB評價標準[15]。SLN陽性：SLN有轉移；SLN陰性：SLN及NSLN均無轉移；假陰性：NSLN有轉移，而SLN無轉移；敏感性計算方法：敏感性=(SLN陽性病例數/肺門縱隔淋巴結轉移病例數)；準確率計算方法：準確率=[(SLN陽性病例數+SLN陰性病例數)/SLN活檢總例數]×100%；假陰性率計算方法：假陰性率=(假陰性病例數/肺門縱隔淋巴結轉移病例數)×100%。

2. RT-PCR檢測CK19mRNA在NSCLC SLN中的表達：將置于-80 ℃冰箱保存的淋巴結(SLN67枚，NSLN79枚)行淋巴結總RNA的提取(TRIzol法)；提取的總RNA行逆轉錄反應(逆轉錄試劑盒購于美國Invitrogen公司，Oligo(dT)18、dNTP、5x buffer、DTT、RNase inhibitor、M-MLV等購于武漢谷歌生物科技有限公司)獲得cDNA；RT-PCR反應獲得DNA樣品，CK19上、下游引物購于日本TOYOBO公司(CK19：5’-TCCGAACCAAGTTTGAGACG-3’和5’-ATTGGCTTCGCATGTCACTC-3’)，actin上、下游引物由上海生工合成(actin： 5’-GTCCACCGCAAAT

GCTTCTA-3’和5’-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3’)，擴增引物在瓊脂糖凝膠上電泳，電泳結果經過成像并圖像分析。

三、統計學方法

所有資料輸入計算機，采用SPSS10.0軟件包進行統計學分析。采用卡方檢驗，若P值小于0.05，則兩樣本率的比較有統計學意義。

結果

術后經病理證實24例患者中鱗癌15例，腺癌9例。術中取得淋巴結總共146枚，平均6～8枚，其中SLN 67枚，NSLN 79枚。67枚SLN中，21枚RT-PCR檢測顯示CK19(+)(圖1，2)，陽性率為31.3%(21/67)， 3枚常規病理HE染色顯示淋巴結轉移(圖3，4)，陽性率為4.5%(3/67)，統計學分析P<0.05，差異具有統計學意義。24例SLN經過RT-PCR檢測后確定病理分期13例N0，9例N1，2例N2。術中SLN主要分布于葉間、肺門、支氣管旁等位置。79枚NSLN中，常規病理HE染色及RT-PCR均未檢出微轉移。參照SLNB評價標準，SLN敏感性為100%，準確率為91.7%(22/24)，假陰性率為0%。

圖1　CK19與actin擴增產物鑒定

圖2　SLN中CK19(+)擴增產物鑒定

圖3　SLN無轉移(HE ×200)

圖4　SLN轉移(HE ×200)

討論

本研究應用RT-PCR檢測CK19mRNA在24例cT1N0M0/ cT2N0M0 NSCLC SLN中的表達，與常規病理HE染色結果進行比較，結果顯示RT-PCR較HE染色微轉移檢出率要高，證明了RT-PCR在NSCLC SLN微轉移診斷中的可行性。而且本研究中有9例患者的病理分期改變，其中13例N0，9例N1，2例N2，比常規病理HE染色TNM分期要準確。另外，參照SLNB評價標準，SLN敏感性為100%，準確率為91.7%(22/24)，假陰性率為0%。在NSLN中常規病理HE染色及RT-PCR均未檢出微轉移，進一步證實了SLN的準確性以及SLNB在NSCLC中應用的可行性。

SLNB不僅可以解決外科醫生在NSCLC淋巴結清掃中所遇到的困擾，同時可以減輕病理科醫生切片檢查的工作量。另外，如果應用RT-PCR或其他更加敏感而簡單的方法檢測SLN中的微轉移，就可以大大提高NSCLC淋巴結微轉移的檢出率，從而精確腫瘤TNM分期，通過輔助治療來提高NSCLC患者的生存率。

本研究所遇到的問題包括：(1)亞甲藍外漏可能污染手術視野，對SLNB造成一定困難；(2)縱隔及肺門淋巴結因黑色物質沉著導致不能辨認淋巴結是否藍染，造成SLN假陰性或假陽性；(3)癌栓堵塞回流淋巴管，導致下一站淋巴結無法示蹤，可能造成SLN假陰性；(4)腫瘤跳躍性轉移會造成SLN假陰性；(5)本研究雖然在NSLN中未檢測出微轉移的存在，但是不排除與樣本量大小有關等原因所導致的微轉移漏檢的存在。

因此，下一步研究方向包括提高SLN定位的準確性、繪制NSCLC的SLN常見轉移區域圖、確定具有NSCLC腫瘤特異性的分子檢測標志物、統一標準的微轉移檢測方法、掌握NSCLC SLN微轉移檢測與長期生存率有關的循證醫學證據等。相信隨著上述問題的解決，SLNB終將會取代NSCLC傳統淋巴清掃術。

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(本文編輯：黃紅稷)

陳曹陽，李軍，陳濤，等. RT-PCR檢測非小細胞肺癌前哨淋巴結微轉移的臨床研究[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2015， 8(4)： 436-439.

·論著·

【摘要】目的探討RT-PCR在非小細胞肺癌(NSCLC)前哨淋巴結(SLN)微轉移診斷中的可行性及其臨床意義。方法選擇24例cT1N0M0/cT2N0M0 NSCLC患者在術中行SLN定位活檢，應用RT-PCR檢測SLN中CK19mRNA的表達來判斷微轉移的存在，與常規病理HE染色結果進行比較，并結合臨床進行分析。結果24例cT1N0M0/cT2N0M0 NSCLC患者(鱗癌15例，腺癌9例)，術中共取得淋巴結146枚，平均6～8枚/例。其中SLN 67枚，非SLN 79枚，SLN敏感性為100%，準確率為91.7%(22/24)，假陰性率為0%。SLN中常規病理HE染色檢出3枚轉移(陽性率為4.5%，3/67)，RT-PCR檢測SLN中21枚CK19陽性(陽性率為31.3%，21/67)，顯著高于常規病理HE染色對SLN微轉移檢出陽性率(4.5%)，差異具有統計學意義(P<0.05)。79枚非SLN中，常規病理HE染色及RT-PCR均未檢出微轉移。結論RT-PCR應用于檢測NSCLC SLN微轉移的診斷是可行的，聯合應用SLN定位活檢，可明顯提高NSCLC淋巴結微轉移的檢出率。此方法可精確NSCLC TNM分期，指導術后輔助治療，有望提高Ⅰ期NSCLC的生存率。

【關鍵詞】非小細胞肺癌；前哨淋巴結；微轉移；細胞角蛋白；逆轉錄聚合酶鏈反應

Detection of micrometastasis of sentinel lymph node in non-small cell lung cancer by RT-PCR and its clinical significanceChenCaoyang1,LiJun2,ChenTao2,ZhouHongmin2,PiYong1,WangZhongming1,ChenYan1.1CardiothoracicandVascularDepartmentofZhongshanHospitalAffiliatedtoWuhanUniversity,Wuhan430033China;2CardiovascularDepartmentofTongjiHospitalAffiliatedtoHuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430000China

Correspondingauthor：LiJun,Email: 910747447@qq.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the feasibility and clinical significance of RT-PCR in diagnosis of micrometastasis of sentinel lymph node(SLN) in non-small cell lung cancer(NSCLC). MethodsA total of 24 cT1N0M0/cT2N0M0 NSCLC patients were intraoperatively using sentinel lymph node biopsy, for detecting the presence of micrometastasis, RT-PCR was applied to detect the expression of CK19mRNA in SLN, pathological and clinical analysis was compared with the conventional HE staining results. ResultsIn 24 cT1N0M0/cT2N0M0 NSCLC cases (15 squamous cell carcinoma cases, 9 adenocarcinoma cases), intraoperatively obtained 146 lymph nodes(average 6 to 8), including 67 SLN and 79 non-sentinel lymph nodes. SLN sensitivity was 100%, accuracy was 91.7%, and false negative rate was 0%. 3 sentinel lymph nodes were detected micrometastasis by conventional pathological HE staining (positive rate 4.5%, 3/67), 21 sentinel lymph nodes CK19-positive by RT-PCR (positive rate 31.3%, 21/67). RT-PCR for detection of positive sentinel lymph node micrometastasis was 31.3%, significantly higher than conventional pathological HE staining positive rate 4.5%, the difference was statistically significant (P<0.05). Metastasis wasn′t detected in 79 non-sentinel lymph nodes. ConclusionsCombined sentinel lymph node biopsy and RT-PCR technique can significantly improve the NSCLC detection rate of lymph node micrometastasis. This method can be accurate TNM staging NSCLC and guide adjuvant therapy to improve stageⅠ NSCLC survival.

【Key words】Non-small cell lung cancer;Sentinel lymph node;Micrometastasis;Cytokeratin;Reverse-transcriptase polymerase chain reaction

收稿日期：(2015-04-27)

文獻標識碼：中圖法分類號： R473.2 A

通訊作者：李軍，Email: 910747447@qq.com

DOI：作者單位： 430033 武漢，武漢大學附屬中山醫院胸心血管外科1;430000 武漢，華中科技大學附屬同濟醫院心臟大血管外科2