產丁醇梭菌優化改造的研究進展

曹長海，關 浩，高慧鵬，佟明友，喬 凱，王領民，張 全

（中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院，生物燃料及生物化工重點實驗室， 遼寧 撫順 113001）

產丁醇梭菌優化改造的研究進展

曹長海，關 浩，高慧鵬，佟明友，喬 凱，王領民，張 全

（中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院，生物燃料及生物化工重點實驗室， 遼寧 撫順 113001）

由于化石燃料資源的緊缺，木質纖維素生物質發酵生產丁醇作為可再生能源的開發備受各國的關注。然而，發酵生產丁醇的工業化進程受限于丁醇產量、產率及比例低等原因。菌種改良無疑是從根本上解決這一問題的重要策略。著重從理化誘變和基因工程兩個方面就近年來國內外產丁醇梭菌改造的最新研究成果進行了相關的評述，進一步展望了菌種改造的發展方向。

丁醇；梭菌；理化誘變；基因工程

隨著化石燃料的不斷消耗以及各國未來對能源供給不足情況的加重，促使人類尋求可再生的能源來代替不可再生的化石燃料。

目前認為，木質纖維素類生物質是世界上最豐富、最廉價的可再生能源［1］，使用木質纖維素類生物質的微生物發酵生產乙醇/丁醇是解決能源問題的重要途徑之一，因此，其作為重要的生物轉化技術逐漸再次受到人們的重視［2，3］，各國科研機構和企業開始重新關注生物發酵生產丁醇的研究。

與乙醇相比，乙醇丁醇的熱值、辛烷值與汽油相當，蒸汽壓低，可與汽油任意比混溶，使用安全性能高；除此之外，丁醇不會腐蝕管道、不易吸水、便于管道運輸［4］，這些優點使丁醇成為了理想的燃油替代品。另外，丁醇也是一種重要的化工原料，廣泛用于各種塑料和橡膠制品的制造，丁醛、丁酸、丁胺和乳酸丁酯等化學品的合成。近年來，隨著下游產業的發展，市場需求量直線上升，有數據顯示，2013年我國正丁醇的進口量在40萬t左右，成為世界上主要的丁醇進口國家之一。

生物發酵生產丁醇的發酵產物為丁醇、丙酮、乙醇，比例為6：3：1。然而，受其生產成本的制約，發酵法與化工合成方法相比較仍缺乏競爭力，主要原因有三：其一，由于丁醇對菌種的毒性，造成發酵液中丁醇的終濃度較低，目前未見丁醇產量超過20 g/L的相關報道；其二，丁醇體積占總溶劑的60%，造成后續溶劑的分離提純成本高；其三，發酵原料（碳源）成本相對較高。針對以上三個問題，科研工作者提出了對應的策略：改良菌種，提高丁醇耐受性和丁醇產量；改進發酵工藝和溶劑分離工藝，降低發酵成本；以可再生、豐富廉價的木質纖維素為原料水解制可發酵糖。其中菌種的改造最為根本，是發酵法生產丁醇工業化大規模生產最直接和最為關鍵的一步。

丁醇發酵工業中的菌種一般是梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)，可以分為 4類：丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)及糖丁酸梭狀芽孢菌(Clostridium Saccharobutylicum)。其中，丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌是國內外科研工作者研究最為深入、應用最為廣泛的兩種菌種，近年來大部分菌種的改造研究也是基于這兩種菌種展開的。本文從理化誘變、基因工程兩方面入手，就近年來國內外產丁醇梭菌菌種改造的最新研究成果進行了相關的評述，并對未來的發展方向提出了展望。

1 理化誘變

1.1 紫外-化學誘變篩選

紫外誘變是一種使用較早、應用廣泛、操作簡單的誘變方法，誘變最為合適的波長為254 nm。紫外線可以促使DNA與蛋白質的交聯，胞嘧啶和尿嘧啶之間的共價連接，從而引起雙聯結構的扭曲變形，阻礙堿基間的正常配對，從而引起突變。化學誘變是指利用化學誘變劑對菌株進行處理，致使其遺傳物質的改變，如DNA的斷裂、缺失、修補，或者造成DNA復制的紊亂及DNA交聯引起的遺傳失效等，常用的化學誘變劑有烷化劑、核酸堿基類似物、亞硝酸、氯化鋰、疊氮化鈉等。在實際的誘變操作中通常為兩種誘變方法的復合使用，彌補由于單因子誘變出現的“熱點”飽和現象，減少無增變效應［5］，從而獲得較高的正突變概率，進一步提高菌種產丁醇的效率。

張麗麗等［6］以Clostridium beijerinckii NCIMB 8052為原始菌株，利用紫外誘變和高丁醇環境馴化相結合的方法，獲得一株耐丁醇的高產突變株Clostridium beijerinckii ZL01，與原始菌株8052相比，ZL01對丁醇初始濃度的耐受能力從10g/L提高到11 g/L, 5 L發酵罐分批發酵的丁醇產量從10.34 g/L增加為15.01 g/L，提高了45.16%，溶劑總產量從12.87 g/L增加到19.55 g/L，提高了49.01%。毛紹名等［7］利用紫外線-氯化鋰復合誘變技術對原始菌株Clostridium acetobutylicum DSM 1731進行了誘變，獲得一株丁醇耐受性和丁醇產量顯著提高的突變菌株M6，與原始菌株1731相比，M6發酵丁醇的最高產量達到了16.01 g/L，產量提高了30.4%，溶劑總產量為20.84 g/L，產量提高了21.3%。

1.2 高能脈沖電子束

高能脈沖電子束(high energy pulsed electron , HEPE)具有極高的輻射劑量率，輻射對生物材料的量劑高達 1010Gy/s，能使水輻解產生更多的羥基自由基，從而對DNA產生顯著的氧化損傷，造成難以修復的 DNA雙鏈斷裂，獲得較多的突變菌株［8］。付玉潔等［9］以Clostridium acetobutylicum CICC 8012為出發菌株，采用HEPE對其進行輻射誘變，再用含丁醇的固體培養基對誘變菌株進行脅迫，經過多次誘變和篩選，獲得誘變株S10，其丁醇產量為8.32 g/L, 較出發菌株產量提高了10%。

1.3 等離子體

常 壓 室 溫等 離子 (atmospheric and room temperature plasma, ARTP)是近年來發展起來的一種等離子體源，它基于射頻大氣壓輝光放電 (radio frequency atmospheric-pressure glow discharge, RF APGD)，能夠在大氣壓下產生溫度在25～40 ℃之間具有高活性離子濃度的等離子體射流，這些活性離子包括處于激發態的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等。這些活性粒子作用于微生物時，能夠改變微生物細胞壁/膜的結構及通透性，并引起基因損傷，進而使微生物基因序列及其代謝網絡發生顯著變化，最終導致微生物產生突變［10］。Guo等［11］利用APGD技術對菌株 Clostridium beijerinckii NCIMB 8052進行處理，獲得誘變菌株Clostridium beijerinckii NCIMB ATR124，在以葡萄糖為碳源的發酵中，丁醇的產量為10.4 g/L、丙酮產量為3.1 g/L、乙醇產量為0.2 g/L，丁醇產量占溶劑總產量的76%，與原始菌株相比提高了7%。此外，該菌株利用木糖/阿拉伯糖為碳源發酵產溶劑的量與單純以葡萄糖為碳源發酵產溶劑的量相當。Li等［12］同樣利用 ARTP對菌株Clostridium acetobutylicum PW 12進行處理，獲得丁醇耐受性好，產量高的誘變菌株 ART18，當以木薯淀粉為碳源的發酵中，丁醇的產量為(11.3±0.5)g/L，比PW12的產量提高了31%，通過優化木薯淀粉的濃度、發酵pH以及維生素的添加等因素，丁醇的最高產量可以達到(15.8±0.8) g/L。

2 基因工程

丙酮丁醇梭菌具有復雜的代謝途徑，能生成乙酸、丁酸、乙醇、丙酮、丁醇等多種代謝產物，其代謝途徑如圖1所示［13］。2001年N?lling等完成了Clostridium acetobutylicum ATCC 824的測序［14］。2007年，美國能源部聯合基因組研究所完成了Clostridium beijerinckii NCIMB 8052的測序［15］。由此，丁醇產生菌的基因工程取得了很大的成效。通過基因的過表達、基因敲除、基因重組以及原生質融合等方法，整合優勢性狀，增加菌種丁醇耐受性、增強丁醇代謝途徑，阻斷乙酸、丁酸及丙酮的代謝通路，從而提高丁醇的產量和比例。

圖1 丙酮丁醇梭菌代謝途徑[19]Fig.1 Metabolic pathway in Clostridium acetobutylicum[19]

2.1 基因的過表達

丙酮丁醇梭菌的溶劑耐受性與很多伴侶基因有關，如groESL、dnaKJ等。Mann等［16］過表達了groESL、grpE及htpG，顯著提高了丙酮丁醇梭菌的丁醇耐受性，野生菌株在體積分數 2%的丁醇中存活無法超過 2h，而基因過表達過的菌株在同樣條件下仍有45%存活。丁醇產生途徑上的關鍵酶有AdhE及Bdh A/B，通過提高兩者的表達水平，可以提高丁醇的產量。方雪等［17］構建了質粒pTAEE，其中的adhE基因以單交換的方式整合到轉化子基因組中，增強了adhE的表達，得到的重組菌T4發酵丁醇得率為41.6%，比野生菌株提高了69%。

2.2 基因敲除

基因敲除是自上世紀 80年代末發展起來的一種新型分子生物學技術，通過一定的途徑使機體特定的基因失活或者缺失［18］，從而達到對生物遺傳物質有目的性的改造，在發酵工業微生物菌種改良種發揮著重要的作用。理論上講，敲除乙酸支路的Pta、Ack基因，丁酸支路的Buk、Ptb基因以及丙酮支路的Adc、CtfA/CtfB基因均可以使代謝流更多的轉向乙酰輔酶A、丁酰輔酶A和乙酰乙酰輔酶A, 從而增強丁醇的代謝流，提高丁醇的產量［19,20］另外，敲除其他的基因同樣可以達到提高丁醇產量的目的，Xu等［21］將菌株 Clostridium acetobutylicum ATCC 55025中的 cac3319組氨酸激酶敲除后得到突變菌株Clostridium acetobutylicum JB200，丁醇的產量由(12.6±1.3)g/L增加到了(18.2±0.2)g/L，相比原始菌株提高了44.4%。

2.3 基因重組

與傳統的育種相比，基因重組是一種通過DNA重組的方式將優勢多母體(multi-partental)基因雜交的方法，是一種較為有效的、向理想表型菌株進化的途徑［22］。Gao等［23］以Clostridium acetobutylicum CICC 8012為出發菌株，經過兩輪基因重組獲得優勢菌株F2-GA，發酵72 h，丁醇/丙酮/乙醇總溶劑的產量達到了22.21 g/L，與出發菌株相比，產量提高了34.53%。

原生質體融合(protoplast fusion)是基因重組的另一種方式，即通過一定的理化條件，使遺傳性狀不同的兩個細胞的遺傳物質以原生質體的方式進行融合，從而獲得具有雙親遺傳性狀的穩定重組子的過程。原生質融合技術可以在種間、屬間及科之間構建出新型的菌株。張延平等［24］以 Clostridium acetobutylicum SMB1 (CGMCC No. 2287)為出發菌株，采用化學誘變和原生質體融合交替進行的方法，獲得對產物有較高耐受性的突變菌株 DGF4，其對丁醇的耐受性可以達到 19 g/L，丁醇產量為 10.43 g/L。劉力強等［25］將Clostridium acetobutylicum ATCC 824菌種的原生質體融合得到突變菌株Clostridium acetobutylicum p1147（CGMCC No: 3686 )，該菌株可以將發酵產物中的丙酮轉化為異丙醇，產生出含有丁醇、乙醇、異丙醇的混合醇，總混合醇產量可達16 g/L。

2.4 工程菌的構建

工程菌是用基因工程的方法，使外源基因得到高效表達的菌類細胞株，常見的有大腸桿菌、酵母菌等。在工程菌中克隆并表達丙酮丁醇梭菌的丁醇合成途徑的關鍵酶基因，從而構建丁醇合成途徑，并通過優化代謝途徑，增強丁醇的代謝流。張艷等［26］克隆Clostridium acetobutylicum ATCC 824丁醇合成途徑關鍵酶基因thil、adhE2和BSC operon，構建產丁醇的工程大腸桿菌，在微好氧和厭氧條件下，該菌發酵丁醇的最大產量約為84 mg/L。Steen等［27］在釀酒酵母中表達了Clostridium beijerinckii的3-羥基丁酸?；o酶A脫氫酶和釀酒酵母及大腸桿菌的乙酰乙酰輔酶A轉移酶，該菌發酵丁醇的產量為2.5 mg/L。

3 展 望

從某種意義上講，細菌是世界上進化最為完美的物種之一，任何人為的改造對其本身來講都是一種“負影響”，菌種改造過程中會出現正突變率低、定向性差等問題，導致現有技術對菌種的改造無法使丁醇等溶劑的產量有大幅度的提升，但是不可否認，產丁醇菌種改造依舊是實現發酵法生產丁醇工業化的根本途徑。菌種改造應該遵循提高丁醇產量和比例的原則，國內外科研工作者在這兩方面開展了大量的研究，取得了一定的成果，并應用于丁醇的實際生產中。除菌種的改良外，從自然界中分離篩選優良性狀的菌種［28］，開發先進的發酵工藝［29］和分離工藝［30］也是提升生物發酵法競爭力的有利手段。相信，隨著丁醇改造技術及其他工藝研究的進一步發展，發酵丁醇產量上的桎梏終究會被突破，發酵法生產丁醇工業化終究會實現。

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Research Progress in Optimization and Improvement of Butanol-producing Clostridia Strain

CAO Chang-hai, GUAN Hao, GAO Hui-peng, TONG Ming-you, QIAO Kai, WANG Ling-ming, ZHANG Quan
（Key Laboratory of Biofuels and Biochemical Engineering, Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals, SINOPEC, Liaoning Fushun 113001，China）

Butanol produced from lignocellulose biomass by fermentation, as a kind of renewable energy has been focused and studied widely in the world as a result of the shortage of fossil fuel. However, the industrialization process of fermentation for producing butanol is limited by yield, productivity and low proportion of biobutanol. Strain improvement is fundamental and important strategy to solve the problem. In this paper, the latest processes of clostridia strain improvement was emphatically summarized from the two aspects of physicochemical mutagenesis and genetic engineering, and the development direction of strain improvement in future was prospected.

Butanol; Clostridia strain; Physicochemical mutagenesis; Genetic engineering

Q 819

A

1671-0460（2015）08-2014-04

中國石油化工集團公司資助項目，項目號：213105。

2015-06-25

曹長海（1983-），男，山東章丘人，工程師，博士學位，2013年畢業于中國石油大學（華東）化學工程與技術專業，研究方向：纖維素酶、發酵工程、生物能源。E-mail：caochanghai.fshy@sinopec.com，電話：024-56389412。

張全（1977-），男，高級工程師，碩士學位，研究方向：纖維素酶、發酵工程、生物能源。E-mail：zhangquang.fshy@sinopec.com，電話：024-56389412。