甘油生產1,3-丙二醇發酵工藝優化研究

姚新武，張 霖，樊亞超

（中國石化撫順石油化工研究院，遼寧 撫順 113001）

甘油生產1,3-丙二醇發酵工藝優化研究

姚新武，張 霖，樊亞超

（中國石化撫順石油化工研究院，遼寧 撫順 113001）

1,3-丙二醇是合成聚對苯二甲酸丙二醇酯的基礎原料，利用甘油進行微生物發酵生產1,3-丙二醇的生物煉制技術具有廣闊的應用前景。以克雷伯氏肺炎桿菌為出發菌種，對菌種保藏方式、發酵體系環境、氮氣通氣比、pH中和劑以及甘油品質等發酵工藝進行了優化研究。實驗結果表明，在較優的工藝條件下，1,3-丙二醇產量可達103.38 g/L。

克雷伯氏肺炎桿菌；1,3-丙二醇；發酵工藝；優化

1,3-丙二醇（1,3-PDO）可用于化妝品、液體清潔劑、防凍液、服裝、室內裝飾材料、工程聚合物等諸多領域。作為一種含有雙功能團的二醇，1,3-PDO最重要的應用方向是與對苯二甲酸縮聚生成聚對苯二甲酸丙二醇酯（PTT）[1]。目前國際上1,3-PDO主要生產廠商有德國Degussa公司、荷蘭Shell公司和美國Du Pont公司，國內1,3-PDO產量較少，主要依靠從國外進口。

1,3-PDO的合成方法分為化學法和微生物法[2]，其中后者以甘油生物轉化法和葡萄糖生物轉化法最為常見。甘油是油脂工業的主要副產物，生物柴油技術的推廣將產生大量的廉價副產物甘油，因此開發條件溫和、原料價廉易得的利用甘油進行微生物發酵生產1,3-PDO的生物煉制技術具有廣闊的應用前景。目前雖然有大量關于1,3-PDO生產的研究，但少有研究關注利用甘油生產1,3-PDO的發酵工藝優化。

本文以克雷伯氏肺炎桿菌（K. pheumoniae）為菌種，對以甘油為底物生產1,3-PDO的發酵工藝進行了優化研究。

1 實驗部分

1.1 菌種

菌種為中國石化撫順石油化工研究院自主篩選的K. pheumoniae FY-5，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC），編號為0798。

1.2 菌種的培養和發酵[3]

種子培養基：酵母粉 3.0 g/L、麥芽粉 3.0 g/L、蛋白胨 5.0 g/L和NaCl 5.0 g/L。

基本發酵培養基：酵母粉 5.0 g/L、K2HPO4·3H2O 10.0 g/L、KH2PO42.0 g/L、NH4Cl 1.0 g/L、NaCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.1 g/L、FeCl3·6H2O 30 mg/L、CoCl2·6H2O 5 mg/L、維生素B125 mg/L和甘油 30.0 g/L。

在含有100 mL種子培養基的250 mL三角搖瓶中接種K. pheumoniae FY-5，37 ℃和140 r/min搖床培養10 h。

以體積分數5%的接種量接入到1 L發酵罐中進行批次發酵，培養基為基本發酵培養基，工作體積為0.7 L，發酵過程pH維持在7.0，發酵溫度為37 ℃，攪拌轉速為300 r/min。

在15 L發酵罐中進行分批補料發酵，培養基為基本發酵培養基，工作體積為7 L，發酵過程中將甘油濃度控制在10～40 g/L，發酵過程pH維持在7.0，發酵溫度為37 ℃，攪拌轉速為300 r/min。

1.3 分析方法

甘油、1,3-PDO用HPLC檢測（Dionex配Bio-Rad HPX-87H色譜柱柱），檢測器為示差檢測器，流動相為0.005 mol/L的H2SO4溶液，流速0.8 mL/min，柱溫65 ℃，具體檢測方法見文獻[4]。

生物量（BIOMASS）采用752型分光光度計測定菌體在600 nm處吸光度（OD600），再根據標準方程將吸光度值轉化成生物量。

2 結果與討論

2.1 菌種保藏方式對1,3-PDO合成的影響

用 NaOH作 pH中和劑，氮氣通氣比為 0.4 m3/(m3·min)（又可稱0.4 vvm），分別從凍干保藏菌種和液體保藏菌種出發，通過48 h發酵實驗考察菌種保藏方式對1,3-PDO合成的影響，實驗結果如表1所示。

表1 菌種保藏方式對1,3-PDO合成影響Table 1 Effect of strain preservation methods on 1,3-PDO synthesis

從表1可以看出，凍干保藏菌種的1,3-PDO產量、生產速率和生物量分別高于液體保藏菌種20.69%、19.42%和5.25%。這是由于菌種經過凍干保藏處理后可以將突變可能性降至較低水平[5]，菌種經長期保藏后再復蘇活化，其體內代謝酶系和代謝通量仍能與保藏前相當，進而使凍干保藏菌種能夠表現出較強的發酵性能。

2.2 發酵體系環境對1,3-PDO合成的影響

用NaOH作pH中和劑，以凍干保藏菌種為出發菌種，分別在空氣通氣比0.2 vvm、不通氣和氮氣通氣比0.2 vvm條件下發酵48 h考察好氧環境、微氧環境和厭氧環境對1,3-PDO合成的影響，實驗結果如表2所示。

從表2可以看出，3種發酵體系環境下1,3-PDO產量和生產速率排序為：氮氣通氣比0.2 vvm＞不通氣＞空氣通氣比0.2 vvm。這是由于菌種的甘油代謝途徑包括氧化和還原兩個途徑，厭氧環境有利于氧化途徑產生的還原力 NADH2進入還原途徑以供給1,3-PDO的合成[6]。此外，還原途徑中的甘油脫水酶（GDHt）是菌種代謝的關鍵限速酶[7]，氧的存在會導致GDHt失活進而抑制菌種合成1,3-PDO[8]。

表2 發酵體系環境對1,3-PDO合成影響Table 2 Effect of fermentation system environment on 1,3-PDO synthesis

2.3 氮氣通氣比對1,3-PDO合成的影響

用NaOH作pH中和劑，以凍干保藏菌種為出發菌種，分別在氮氣通氣比0.2 vvm、0.4 vvm和0.6 vvm 條件下發酵 48 h考察不同氮氣通氣比對1,3-PDO合成的影響，實驗結果如表3所示。

表3 氮氣通氣比對1,3-PDO合成影響Table 3 Effect of nitrogen ventilation ratio on 1,3-PDO synthesis

從表3可以看出，菌種的各項發酵指標隨氮氣通氣比的增加呈現先上升后下降的趨勢。當氮氣通氣比為0.4 vvm時，1,3-PDO產量、生產速率和生物量達到最高水平。

2.4 pH中和劑種類對1,3-PDO合成的影響

用Ca(OH)2作pH中和劑，以凍干保藏菌種為出發菌種，分別在不通氣、氮氣通氣比0.2 vvm和氮氣通氣比0.4 vvm條件下發酵48 h考察Ca(OH)2對1,3-PDO合成的影響，實驗結果如表4所示。

表4 Ca(OH)2對1,3-PDO合成影響Table 4 Effect of Ca(OH)2on 1,3-PDO synthesis

從表4可以看出，與NaOH作為pH中和劑相比（見表 2），在相同條件下，使用Ca(OH)2作pH中和劑時菌種的發酵水平有顯著提高，最高1,3-PDO產量和生產速率分別為103.38 g/L和2.15 g/(L·h)。究其原因，一方面是由于Ca2+能改善細胞膜的通透性[9]，進而提高了底物和產物的跨膜運輸效率；另一方面是由于Ca2+能有效地沉淀發酵過程中產生的 CO2，促使脫羧反應朝正向進行，期間生成的還原力提高了菌種代謝的還原途徑通量，進而提高了菌種發酵水平。

分別使用NaOH和Ca(OH)2作pH中和劑時，發酵液電導率隨時間變化趨勢如圖1所示。

圖1 發酵液電導率隨時間變化趨勢Fig.1 Changing trend of electrical conductivity of fermentation broth with time

從圖1可以看出，發酵液電導率隨時間呈現出先上升后趨于穩定的趨勢，使用NaOH作為pH中和劑時發酵液的電導率始終高于Ca(OH)2，終止發酵時，使用NaOH作為pH中和劑的發酵液電導率為20.12 mS，比Ca(OH)2的15.11 mS高出33.16%，說明使用NaOH作為pH中和劑時發酵液的離子強度和滲透壓較高，而過高的離子強度和滲透壓將導致細胞破裂死亡[10]，不利于菌種的生長和代謝。此外，從后續分離提純角度考慮，鈣離子比鈉離子更易從發酵液體系中除去[11]。

2.5 甘油品質對1,3-PDO合成的影響

為考察菌種的原料適應性，本文選取了兩種甘油作為原料。精甘油為北京化工廠生產，化學純。粗甘油為生物柴油副產物，其組成為：甘油含量84.71%、甲醇含量0.74%、甘油單甲醚含量0.0061%、甘油二甲醚含量0.021%，其余為水。

分別以精甘油和粗甘油作為發酵底物，以凍干保藏菌種為出發菌種，在氮氣通氣比0.4 vvm條件下，分別用NaOH和Ca(OH)2作pH中和劑，發酵48 h考察甘油品質對1,3-PDO合成的影響，實驗結果如表5所示。

表5 甘油品質對1,3-PDO合成影響Table 5 Effect of glycerol quality on 1,3-PDO synthesis

從表5可以看出，使用NaOH和Ca(OH)2作pH中和劑，以粗甘油作為發酵底物時菌種的1,3-PDO產量相比于精甘油分別下降了6.99%和29.44%。這是由于粗甘油中存在的生物柴油酯類、機械雜質以及其他雜質對菌種的生長和代謝具有一定抑制作用，進而導致菌種的發酵水平出現下降。這也意味著菌種的原料適應性不強，在使用粗甘油作為發酵底物前，應對其中雜質進行適當預處理。

3 結 論

（1）以凍干形式保藏的菌種具有良好活性，在發酵實驗中表現出了較優的發酵性能。

（2）厭氧發酵環境有利于菌種合成1,3-PDO，當氮氣通氣比為0.4 vvm時1,3-PDO產量最高。

（3）使用Ca(OH)2作為pH中和劑時，發酵48 h菌種的1,3-PDO產量最高可達103.36 g/L。

（4）為滿足菌種的原料適應性，生物柴油副產物粗甘油需進行預處理，將其中抑制菌種生長和代謝的雜質去除后，使其更加適用于微生物發酵生產1,3-PDO。

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Optimization of Fermentation Process for Producing 1,3-PDO From Glycerol

YAO Xin-wu, ZHANG Lin, FAN Ya-chao
(Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals, SINOPEC, Liaoning Fushun 113001, China)

1,3-PDO is the basic raw material to produce polytrimethylene terephthalate. Biorefinery technology of producing 1,3-PDO from glycerol with ferment has broad application prospect. In this paper, K. pneumoniae was chosen as the starting strain. Fermentation process parameters including strain preservation methods, fermentation system environment, nitrogen ventilation ratio, pH neutralizing agent and glycerol quality were optimized. The experimental results show that the yield of 1,3-PDO can reach to 103.38 g/L under optimum process conditions.

Klebsiella pheumoniae; 1,3-PDO; Fermentation process; Optimization

TQ 923

A

1671-0460（2015）08-1813-03

中國石油化工集團公司資助項目，項目號SH1112。

2015-06-27

姚新武（1986-），男，黑龍江大慶人，助理工程師，碩士，2012年畢業于北京化工大學微生物與生化藥學專業，研究方向：生物基化學品研究與開發。E-mail：yaoxinwu.fshy@sinopec.com, 電話：024-56389324。