遠隔缺血后適應對腦缺血的保護及相關機制

曾延源姚聲濤*蒲 舉

（1、貴州省遵義醫學院，貴州遵義563000；2、貴州省遵義醫學院附屬醫院，貴州遵義563000）

?綜述及其他?

遠隔缺血后適應對腦缺血的保護及相關機制

曾延源1、2姚聲濤1、2*蒲 舉1、2

（1、貴州省遵義醫學院，貴州遵義563000；2、貴州省遵義醫學院附屬醫院，貴州遵義563000）

對于急性中風患者施行早期有效的溶栓治療，恢復缺血腦組織的血流和功能已成為臨床公認有效的治療手段。但溶栓治療有嚴格的時間窗限制，且并發癥很多，為了解決這一難題，“缺血預適應”對腦組織缺血／再灌注損傷保護作用的研究進入了人們的視線。目前已有研究證明遠隔缺血后適應的腦保護作用。但作用機制尚不明確。因此本課題的目的是應用遠隔缺血后適應模型即腦缺血后給予遠隔器官（雙下肢缺血處理）研究遠隔缺血后適應對腦缺血的保護作用及機制。基于既往的研究結果，我們提出了這樣假說：腦缺血再灌注時給予雙側或單側下肢的缺血可以對腦缺血造成的損傷具有保護作用，其保護機制可能是多方面，一方面，可能通過減輕缺血再灌注的損傷，從而減輕了缺血引起的血腦屏障的損傷；另一方面，可能遠隔器官的缺血產生了神經保護物質。本課題研究，為將來急性腦梗塞的臨床治療，特別是通過神經保護治療措施，延長治療時間窗提供新的理論依據。

遠隔缺血；腦缺血的保護；血腦屏障，相關機制

腦缺血會對神經元造成不可逆的損傷，目前對于此疾病研究的重點和難點就是尋找對于神經損傷有效的預防治療方法。目前，公認的有效減輕缺血/再灌注損傷的方法有缺血預適應，是指機體在經歷一次或數次短暫性缺血會使內源性的保護機制被激發，減輕缺血對機體產生的嚴重損傷[1-3]。1985年Murry[4]在對于犬的心臟缺血模型研究中提出缺血預適應，此后，缺血預適應對腦組織的保護作用在大量動物實驗中也得到了證實，但由于臨床上難以預測缺血事件的發生，所以限制了其在臨床的應用。缺血后適應的提出彌補了缺血預適應在臨床應用的不足，缺血后適應是在長期缺血之后，進行再灌注之前，給予短暫性的、重復非致死性的預缺血。腦缺血的預適應和后適應保護機制是人體內固有的內源性自我保護機制。其可以減少在再灌注損傷過程中觸發因素的發生，常見的有促炎癥細胞因子、中性粒細胞、氧化、粗凋亡因子等，使對于靶細胞的損傷和凋亡情況發生減少，梗死面積縮小。遠隔缺血后適應對腦有重要的保護意義，是目前公認的對于急性中風患者早期溶栓，使血腦組織供血得以恢復的有效治療手段。但應用中存在兩個問題，一個是時間窗的問題，另一個是再灌注損傷，其成為對溶栓效果重要的影響因素，會使處于缺血的神經細胞在血流恢復后出現死亡。所以對于溶栓時間窗的延長可以使再灌注損傷的情況減輕，但這是臨床有待解決的問題。近些年隨著醫療技術的發展，腦血管經皮介入技術的研究應用，后適應性的臨床應用提供了可能性。本研究通過測定腦組織、腦脊液、血液里MMPs、VEGF、BDNF、GDNF的mRNA表達及蛋白含量，證明遠隔缺血后適應對缺血/再灌注損傷的保護機制為減輕血腦屏障損傷及產生神經保護因子。

1 材料與試劑

Sprague Dawley遠交群大鼠(SD大鼠)共計200只，由第三軍醫大學實驗動物中心提供；ELISA檢測試劑盒，由上海寶曼生物科技有限公司提供。

1.1 動物模型建立

應用缺血/再灌注損傷大鼠模型制備穩定的大鼠雙下肢的遠隔缺血后適應模型。

1.2 遠隔缺血后適應對腦缺血保護的研究

通過神經行為學評估及腦梗死體積變化證明遠隔缺血后適應對缺血/再灌注損傷的保護作用

1.3 指標測定

測定腦組織、腦脊液、血液里MMPs、VEGF、BDNF、GDNF的mRNA表達及蛋白含量，證明遠隔缺血后適應對缺血/再灌注損傷的保護機制為減輕血腦屏障損傷及產生神經保護因子。

2 實驗方法

2.1 大鼠腦缺血60min、90min、120min后再灌注同時給予遠隔缺血后適應。探討缺血后適應的保護作用是否與腦缺血的嚴重程度有關，為臨床應用提供理論依據；遠隔缺血后適應對腦缺血的保護作用實驗分組：SD大鼠120只，隨機分為10組，每組12只。假手術組：僅暴露頸動脈；對照組：行單純缺血再灌注；大鼠腦缺血60min，予遠隔缺血后適應干預，再灌注后24h、72h、4w三組，大鼠腦缺血90min，予遠隔缺血后適應干預，再灌注后24h、72h、4w三組，大鼠腦缺血120min，予遠隔缺血后適應干預，再灌注后24h、72h、4w三組。大鼠腦缺血后再灌注不同時間點（早期24h及晚期4w），重新制作模型留取幾組標本，包括腦組織、腦脊液及血液，電鏡檢查血腦屏障的損傷，并測定腦干濕比重。測定血液及腦脊液、MMPs、VEGF、BDNF以及GDNF的表達。免疫組化染色定位腦組織NeuN、MMPs、VEGF、BDNF以及GDNF的表達。Western Blot定量MMPs、VEGF、BDNF以及GDNF。采用雙盲法用無偏見細胞立體學定量分析免疫組織化學染色結果，用方差分析差異（ANOVA）及post hoc Student-Newman-Keul檢測進行分析，P<0.05視為有統計學差異。用光密度掃描對Western Blot條帶進行半定量分析，與對照組光密度倍數的差異用方差分析（ANOVA）及post hoc Student-Newman-Keul進行分析血液、腦脊液以及腦組織各種因子的變化及相關關系。

2.2 研究遠隔缺血后適應對腦缺血血腦屏障損傷及神經保護物質的影響

遠隔缺血后適應對腦缺血保護機制實驗分組：SD大鼠80只，隨機分8組，每組10只。假手術組：僅暴露頸動脈；對照組：行單純缺血再灌注；大鼠腦缺血60min，予遠隔缺血后適應干預，再灌注后24h、4w兩組大鼠腦缺血90min，予遠隔缺血后適應干預，再灌注后24h、4w兩組大鼠腦缺血120min，予遠隔缺血后適應干預，再灌注后24h、4w兩組。大腦缺血60min，90min，120min再灌注損傷模型再灌注即給予雙側股動脈夾閉10min，放松10min，重復3次。分別于再灌注后24h，72h，4w，進行神經功能評分，用方差分析差異（ANOVA）及post hoc Student-Newman-Keul檢測進行分析，P<0.05視為有統計學差異。在灌注后24h，72h，4w處死大鼠TTC染色測定腦梗死體積，用方差分析差異（ANOVA）及post hoc Student-Newman-Keul檢測進行分析。

圖1 MCAO模型

圖2 TTC染色測定腦梗死體積

圖3 電鏡檢查血腦屏障損傷

圖 4 The comparision of CBF at different time points.A: before MCA occlusion;B:0 min after MCA occlusion;C:10 mins after MCA occlusion;D:1h after MCA occlusion;E:0 min after MCA reperfusion;F:1st of CCA occlusion;G:1st of CCA reperfusion;H:2nd of CCA occlusion;I:2nd of CCA reperfusion;J:3rd ofCCA occlusion;K:3rd ofCCA occlusion;L:4th ofCCA occlusion;M:4th ofCCA reperfusion;N:5th ofCCA occlusion;O:5th ofCCA reperfusion;P:30 min after MCA reperfusion.The CBF of the control,u-CCA-O,and b-CCA-O group are analyzed using one-way ANOVA.(±s).n=7.

圖 5 The comparision of functional neurological outcome at different time points.The functional neurological outcome of control,u-CCA-O,and b-CCA-O group are analyzed at 1h after MCA occlusion using one-way ANOVA,（±s）,n=7,○: P=0.000<0.05 vs control;△:P=0.008<0.05 vs control.

3 結果

3.1 本研究室具備穩定的MCAO模型，如圖1

3.2 我們在全程監測各項生理指標以及腦血流的情況下建立了雙側頸總動脈夾閉的缺血后適應模型，在此基礎上研究了缺血后適應對腦缺血的保護作用及機制。發現：（1）缺血后適應不影響血壓、血糖、血氣以及體溫無影響。（2）雙側頸總動脈缺血后適應可能會減少再灌注時的腦血流過灌注現象（見圖2）。（3）雙側頸總動脈缺血后適應減少了神經功能的缺損程度（見圖3）。（4）雙側頸總動脈缺血后適應降低了腦梗死體積（見圖4-6）。

圖 6 The comparision of the infarct volume.The infarct volume of control,u-CCA-O,and b-CCA-O group are analyzed using one-way ANOVA,（±s）,n=7,□:P=0.001< 0.05 vs control;△:P=0.000<0.05 vs control.

3 討論

遠隔缺血預適應（Remoteischemicpreconditioning，RPC）以及缺血后適應的所有研究結果使我們在腦缺血的研究中寄希望于遠隔缺血后適應（remote ischemic postconditioning），即為了治療腦缺血性損傷，在腦缺血性損傷后，給于其他某一器官短暫的亞致死性IR，例如肢體，能夠在遠隔臟器，如腦產生缺血保護。遠距離缺血后適應是機體對自身損傷的一種天然保護機制，其可以通過機體不太重要的器官例如肢體來進行后適應干預，從而保護心臟和腦等重要器官的損傷，臨床應用價值較大。目前已有研究證明遠隔缺血后適應的腦保護作用。但作用機制尚不明確。

因此本課題的目的是應用遠隔缺血后適應模型即腦缺血后給予遠隔器官（雙下肢缺血處理）研究遠隔缺血后適應對腦缺血的保護作用及機制。基于既往的研究結果，我們提出了這樣假說：腦缺血再灌注時給予雙側或單側下肢的缺血可以對腦缺血造成的損傷具有保護作用，其保護機制可能是多方面，一方面，可能通過減輕缺血再灌注的損傷，從而減輕了缺血引起的血腦屏障的損傷；另一方面，可能遠隔器官的缺血產生了神經保護物質。

本課題研究，為將來急性腦梗塞的臨床治療，特別是通過神經保護治療措施，延長治療時間窗提供新的理論依據。

遠隔缺血后適應對腦有重要的保護意義，是目前公認的對于急性中風患者早期溶栓，使血腦組織供血得以恢復的有效治療手段。但應用中存在兩個問題，一個是時間窗的問題，另一個是再灌注損傷，這兩者嚴重影響著患者的溶栓效果，易導致缺血狀態下的神經細胞在恢復血流后出現死亡。所以對于溶栓時間窗的延長可以使再灌注損傷的情況減輕，但這是臨床有待解決的問題。近些年隨著醫療技術的發展，腦血管經皮介入技術的研究應用，后適應性的臨床應用提供了可能性。

［1］ Matsushima K，Hakim AM．Transient forebrain ischemia protects against subsequentfocal cerebral ischemia without changing cerebral perfusion[J].Stroke，1995,26(6)：1047-1052．

［2］ Dirnagl U,Simon RP,Hallenbeck JM.Ischemic tolerance and endogenous neuroprotection [J].Trends Neurosci,2003,26 (5):248-254.

［3］ 李春梅,張興華,馬曉靜,等.肢體缺血后處理對兔急性心肌缺血再灌注損傷的影響 [J].中國病理生理雜志,2006,22(12): 2332-2335．

［4］ Murry CE,Jennings RB,Reimer KA.Preconditioning with ischemia :a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium[J].Circulation, 1986,74(5)：1124-1136.

Distant postconditioning protection and related mechanisms of cerebral ischemia

Zeng YanYuan1、2,YaoShengTao1、2*,Pu Ju1、2
（1.Hospital Affiliated Zunyi Medical College;Guizhou Zunyi 563000 2.Zunyi Medical College,Guizhou Zunyi 563000）

For patients with acute stroke early and effective implementation of thrombolytic therapy to restore blood flow and function of ischemic brain tissue has become recognized as an effective clinical treatment.Thrombolytic therapy but there are strict time window constraints,and a lot of complications,in order to solve this problem,"ischemic preconditioning"The study of cerebral ischemia/reperfusion injury into the people's attention.At present,studies have shown that the protective effect of adaptation after ischemic brain distant.But the mechanism is not clear.So the purpose of this project is to adapt the model after applying distant ischemic cerebral ischemia given that distant organs(double limb ischemia treatment)study distant after ischemia protective effect and mechanism of adaptation cerebral ischemia. Based on previous findings,we propose such a hypothesis:given bilateral or unilateral lower limb ischemia can cause damage to the brain has a protective effect of ischemic cerebral ischemia and reperfusion,the protective mechanism may be multifaceted,on the one hand probably by reducing ischemia-reperfusion injury,thus reducing the blood-brain barrier damage caused by ischemia;on the other hand,may be distant organ ischemia produced a neuroprotective substances.This research for future clinical treatment of acute cerebral infarction,particularly through neuroprotective treatment,prolonged treatment time window to provide a new theoretical basis.

Distant ischemia;cerebral ischemia protection;mechanisms

曾延源，1982年生，男，漢族，研究生，住院醫師，主要從事神經病學方面工作。

*姚聲濤為本文通訊作者。