反相高效液相色譜法測定大鼠腦組織中4種氨基酸類神經遞質

張宇浩 馬昱 郭曦 王勤 曹志娟

（1.復旦大學附屬中山醫院神經內科，上海 200032；2.復旦大學附屬中山醫院分部內科，上海 200052；3.空軍94789部隊機關醫院口腔科，江蘇南京 210018；4.復旦大學藥學院，上海 200032）

存在于腦組織和腦脊液中的多種氨基酸類神經遞質，對于調節機體生理活動具有重要作用，其含量及比例的變化伴隨著多種中樞神經系統疾病的發生及發展［1］。其中，谷氨酸（glutamate，Glu）和天門冬氨酸（aspartate，Asp）是腦部的興奮性神經遞質，牛磺酸（taurine，Tau）是腦部的抑制性神經遞質，γ－氨基丁酸（γ－aminobutyric acid，γ－GABA）的作用較為復雜。測定神經遞質含量的變化對于神經系統疾病的診斷、治療和預后分析有重要的參考價值。常用的氨基酸類神經遞質的測定方法為高效液相色譜法、微流控、電泳法分離與衍生化后熒光檢測相結合［2－3］。通常采用丹酰氯衍生化、鄰苯二甲醛（O－phthalaldehyde，OPA）、2，4－二硝基氟苯、2，6－二甲基－4－喹啉羧酸－N－羥基琥珀酰亞胺酯［4］等試劑進行柱前衍生熒光檢測氨基酸的含量［4］。其中，OPA檢測的靈敏度高，衍生化反應迅速安全。本研究對大鼠腦組織中的神經遞質的測定，采用OPA作為柱前衍生化試劑，建立一種簡單、快速、靈敏的高效液相色譜技術，以期為神經系統疾病發病機制的研究提供方法基礎。

1 資料與方法

1.1 試劑和儀器 Asp、Glu、γ－GABA、Tau和OPA（純度80%）購自于上海日初生化有限公司；高絲氨酸（homoserine，Hse）和β－巰基乙醇購自于Sigma公司。乙腈和甲醇購于漢邦試劑有限公司，均為一級色譜純。高氯酸、磷酸二氫鉀、碳酸鉀等試劑均購自于國藥試劑集團，分析純。超純水由Millipore公司生產的Milli－Q純水儀制備。

液相色譜儀系統：HITACHI L2000型高效液相色譜儀，包括 Hitachi Organizer（試劑架），L－2130型四元泵、L－2200型自動進樣器，L－2300型柱溫箱，L－2455型二極管陣列檢測器，L－2485型熒光檢測器，日立色譜工作站，由日本日立公司提供。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為Dikma Inertsil ODS（250mm× 4.6mm，3.5μm），預柱 Dikma，C18，4.0mm×3.0mm。流動相為磷酸二氫鉀緩沖液（0.1mol／L，pH 6.0）∶甲醇∶乙腈 （6∶3∶1）；流速為1mL／min；檢測條件：熒光檢測器，激發波長為345nm，發射波長為460nm。柱溫40℃，進樣量20μL。

1.2.2 試劑配制

1.2.2.1 衍生化試劑的配制及衍生反應 稱取13.4mg的OPA溶于1mL的乙醇中，加入20μL β－巰基乙醇以及4mL四硼酸鈉緩沖液（0.1mol／L，pH 9.6）。密封后低溫保存。隔天加入20μLβ－巰基乙醇。標準溶液和預處理后樣品精密量取40 μL，加入OPA衍生劑20μL輕輕混勻，靜置2min，進樣20μL進行高效液相色譜分析。以保留時間定性，峰面積內標法定量。

1.2.2.2 儲備液的配制 精密稱定 Asp 13.10 mg、Glu 14.71mg、γ－GABA 10.31mg 和 Tau 12.53mg，分別置10mL容量瓶中，加入含50%甲醇的0.1mol／L碳酸鉀溶液（Buffer A）定容，制得濃度為10mmol／L的各種氨基酸母液。精密稱取Hse 119.12mg置100mL量瓶中，加入Buffer A溶解，定容制得10mmol／L的內標母液。精密吸取Asp、Glu、γ－GABA和Tau母液各1.0mL，分別置10mL量瓶中，Buffer A稀釋定容，作為1號儲備液（1mmol／L）；再次精密吸取1mL各氨基酸的1號儲備液，分別置10mL量瓶中，Buffer A定容作為2號儲備液（100μmol／L），－20℃保存。提取回收率儲備液配制：精密吸取10mmol／L的 Asp、Glu、γ－GABA和Tau母液0.3mL置于同10mL量瓶中，Buffer A稀釋定容即得3號混合標準儲備液（0.3 mmol／L）。

精密量取3mL的內標母液置100mL的量瓶中，Buffer A稀釋定容可得1號內標儲備液（0.3 mmol／L）；精密量取1mL的內標母液，置10mL的量瓶中，Buffer A稀釋定容可得2號內標儲備液（1mmol／L）；精密量取2號內標儲備液1mL，置100mL容量瓶中，用Buffer A稀釋定容得3號內標儲備液（10μmol／L）。

1.2.3 標準曲線的繪制 分別精密量取Asp、Glu、γ－GABA、Tau的2號儲備液各1.0mL置同一個10mL量瓶中，用Buffer A稀釋定容，作為1號工作液（10μmol／L）。隨后，精密取1號工作液0.1 mL、0.2mL、0.5mL、1mL、2mL和3號內標儲備液1mL置同一個10mL量瓶中，用Buffer A稀釋定容，作為2、3、4、5、6號工作溶液，濃度依次為0.1 μmol／L、0.2μmol／L、0.5μmol／L、1μmol／L、2 μmol／L的混合標準品溶液，其中內標液濃度均為1 μmol／L。按以上實驗條件進樣，每次進樣20μL，測定混合標準氨基酸中各組分的峰面積，計算其與內標峰面積的比值，并擬合標準曲線回歸方程。

1.2.4 精密度和準確度測定 配制濃度為0.5 μmol／L氨基酸混合標準品溶液5管，按標準曲線制備的方法處理，衍生后進樣測定，計算日內精密度和回收率；以相同方法配制相同濃度的標準品5份，連續3d，按上述方法進行測定，計算日間精密度和回收率。

1.2.5 提取回收率 取0.4mL人工腦脊液（配置方法：每100mL蒸餾水含NaCl 730mg，KCl 10 mg，NaH2PO4·H2O 12.5mg，Na2HPO4·12H2O 71mg，MgCl2·6H2O 20mg，CaCl218mg，D－葡萄糖90mg，pH 7.3～7.5），加入50μL的3號混合標準儲備液（0.3mmol／L）和50μL的3號內標儲備液（0.3mmol／L），再加入1mL 的 HClO4（0.4 mol／L）去蛋白，混勻后，4℃條件下，3 000r／min低溫離心15min，取上清液0.5mL，加入2mol／L K2CO3溶液1mL，再加入0.1mol／L K2CO3稀釋至5mL，4℃條件下，14 000r／min低溫離心20 min，取上清，4℃保存，衍生后，分別取20μL進樣，計算提取回收率的4種氨基酸的濃度CX（μmol／L）。按下列公式計算提取回收率。回收率（%）＝30 000CX／C0×100%，其中C0為3號混合標準儲備液的濃度（0.3mmol／L）。

1.2.6 腦組織樣品預處理 SD大鼠（中國科學院上海生命科學研究院實驗動物中心提供）1只，體質量248g，快速斷頭取腦，放在冰盤上分離腦組織，留取海馬組織，精密稱質量后，加入0.8mL人工腦脊液，手動玻璃勻漿器冰浴勻漿，4℃條件下，3 000r／min低溫離心15min，取上清液0.4mL，加入50 μL的3號混合標準儲備液（0.3mmol／L）和50μL的3號內標儲備液（0.3mmol／L）和1mL的HClO4（0.4mol／L）去蛋白，混勻后，4℃條件下，3 000r／min低溫離心15min，取上清液0.5mL，加入2mol／L K2CO3溶液1mL，再加入0.1mol／L K2CO3稀釋至5mL，4℃條件下，14 000r／min低溫離心20min，取上清液，4℃保存，用前衍生后進樣。

2 結 果

2.1 4種氨基酸的分離 4種氨基酸類神經遞質在15min內均得以很好的分離，其保留時間分別為：Asp 3.60min，Glu 3.89min，Hse 7.45min，Tau 11.47min，γ－GABA 13.29min。各種氨基酸峰形良好，無重合、雙峰、拖尾等現象。樣品中的其他雜峰亦可與待測氨基酸完全分離。

2.2 線性范圍和相關系數 系列濃度的混合氨基酸標準品（2～6號工作溶液）進行HPLC檢測后，各峰面積與濃度間呈現良好線性關系。以各種氨基酸組分濃度（C）為橫坐標，相應的峰面積（A）與內標峰面積（A0）的比值為縱坐標，進行回歸，其濃度與峰面積呈良好線性關系，得到的回歸方程式：y＝ax＋b。其中y為峰面積比值，a為斜率，x為各氨基酸的濃度，b為截距，相關系數r。見表1。

表1 各種氨基酸的標準曲線方程

2.3 精密度和準確度 在所建立的HPLC方法下，測定同一樣品中4種氨基酸的精密度，結果顯示其重現性較好，高、中、低3個標準溶液連續5次進樣，Asp、Glu、Tau和γ－GABA峰面積與內標峰面積比值的日內和日間變異系數分別為0.61%～7.91%、4.78% ～6.26%、10.5% ～16.3% 和 0.27% ～10.98%，回收率分別為90.5%～111.3%、90.8%～101.5%、98.6%～101.9%和95.6%～104.4%。2.4 提取回收率試驗 3個空白樣品中添加低、中、高3個濃度水平的標準品完成，經過樣品預處理方法進行處理后，對比檢測量和實際量，多次測定Asp、Glu、Tau 和 γ－GABA 提 取 回 收 率 分 別 為91.1%～112.2%、82.7% ～99.3%、66.8% ～98.8%和86.2%～104.0%。

3 討 論

本研究采用OPA柱前衍生，建立了一種高效液相－熒光檢測技術，方法準確靈敏、重現性好，適合于腦組織樣品中各種氨基酸的檢測。本研究用的熒光衍生試劑純度為80%，帶入了一些干擾成分，雖然在本研究條件下，干擾成分不影響4種氨基酸的測定，但可考慮在以后的研究中換用更純的試劑，以降低干擾。由于OPA試劑性質活潑，放置于空氣中易氧化，因此在其保存液中加入β－巰基乙醇，對OPA具有保護作用，并將其保存于較低溫度也可防止其氧化變質。此外，腦組織樣品中也具有多種成分的干擾，本研究中采用60mmol／L磷酸鹽濃度作為流動相添加劑，獲得了較好的峰形和分離度。從圖譜上可以看出，若樣品中添加其他的氨基酸如組氨酸（6.12min）、甘氨酸（8.87min）等，其測定將一定程度上受到組織樣品的干擾，后續研究將進一步觀察流動相組成成分和比例，以期用于更多組分的檢測。

［1］ Kalra SP，Dube MG，Pu SY，et al.Interacting appetite－regulating pathways in the hypothalamic regulation of body weight［J］.Endocrine Rev，1999，20（1）：68－100.

［2］ Sandlin ZD，Shou MS，Shackman JG，et al.Microfluidic electrophoresis chip coupled to microdialysis for in vivo monitoring of amino acid neurotransmitters［J］.Anal Chem，2005，77（23）：7702－7708.

［3］ Cellar NA，Burns ST，Meiners JC，et al.Microfluidic chip for low－flow push－pull perfusion sampling in vivo with on－line analysis of amino acids［J］.Anal Chem，2005，77（21）：7067－7073.

［4］ Huang KJ，Yu S，Li J，et al.Extraction of neurotransmitters from rat brain using graphene as a solid－phase sorbent，and their fluorescent detection by HPLC［J］.Microchim Acta，2012，176（3－4）：327－335.