侵染小蘋果的蘋果銹果類病毒的檢測和全序列分析

郝 璐， 葉 婷， 王少杰， 國立耘， 范在豐， 周 濤

（中國農業大學植物病理學系，北京 100193）

研究簡報

侵染小蘋果的蘋果銹果類病毒的檢測和全序列分析

郝 璐， 葉 婷， 王少杰， 國立耘， 范在豐， 周 濤*

（中國農業大學植物病理學系，北京 100193）

小蘋果是抗寒海棠類與大蘋果的雜交后代，因耐寒能力強，口感好，被廣泛用于嫁接與育種材料，是我國寒涼蘋果產區寶貴的種質資源。蘋果銹果類病毒（Apple scar skin viroid，ASSVd）侵染蘋果后引起果實表面產生銹狀斑、花臉、畸形等癥狀，嚴重降低果實品質和市場價值。2013年在調查蘋果病毒病時發現北京市延慶縣種植的小蘋果表現出典型畸形癥狀，應用RT-PCR方法對其進行檢測后經測序和序列分析表明，小蘋果被蘋果銹果類病毒侵染?？寺〈朔蛛x物（ASSVd-YQ）全基因組序列，分析后得到其基因組全長為329個核苷酸，系統發育分析表明該分離物與來自不同國家和地區的ASSVd分離物間的進化關系極近。二級結構預測表明，該分離物的中央保守區與末端保守區與ASSVd參考序列相同。這是對侵染小蘋果的ASSVd的首次檢測和鑒定。

蘋果銹果類病毒； 小蘋果； 分子檢測； 序列分析

蘋果銹果類病毒（Apple scar skin viroid，ASSVd）為馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科（Pospiviroidae）蘋果銹果類病毒屬（Apscarviroid）代表成員，可以侵染蘋果（Malus domesticaBorkh.）［1］、梨（PyruscommunisL.，P.amygdaliformisL.）［2］、桃［Prunus persica（L.）Batsch］［3］、杏（P.armeniacaL.）［4］和野櫻桃（P.cerasoidesD.Don）［5］等植物。目前還沒有發現傳播介體，主要通過嫁接與自然根接傳播。ASSVd基因組為單鏈環狀RNA，長約330個核苷酸，具有5個功能區，能形成穩定的桿狀和擬桿狀的二級結構，具有一個中央保守區（CCR）和一個末端保守區（TCR）［6］。蘋果銹果類病毒侵染蘋果后在果實上引起銹果、花臉等癥狀，降低了果實的商品價值，是蘋果上危害非常嚴重的一種類病毒，目前在中國［1］、希臘［2］、印度［5］、日本［7］等地都有發生。

小蘋果為蘋果屬（MalusMill.）成員，主要分布在我國東三省和內蒙古東部，是大蘋果與抗寒海棠類的雜交后代，因其單果重一般在50～100 g，故稱為小蘋果［8］。由于部分品種具有耐旱、耐寒等特性，被廣泛用于蘋果嫁接以及育種材料。2013年秋天在北京延慶調查蘋果病毒病害時，發現部分小蘋果果實表現出明顯的畸形癥狀。采回發病果實，提取總RNA經RT-PCR檢測和測序證實該果實被蘋果銹果類病毒所侵染，這是對侵染小蘋果的ASSVd的首次分離和鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

2013年10月在北京延慶縣采集帶有畸形癥狀的小蘋果與健康的小蘋果，整理后保存在4℃冰箱中。

RT-PCR所用的陽性對照為本實驗室保存的含ASSVd基因的質粒。

總RNA提取試劑盒購自北京博邁德生物公司；d NTPs購自羅氏公司；M-MLV反轉錄酶和RNA酶抑制劑購自Promega公司；TaqDNA聚合酶購自北京奧賽博生物技術有限公司；瓊脂糖購自BioWest；DNA Marker購自北京全式金生物技術有限公司；DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；T4 DNA連接酶、p MD18-T克隆載體、10×Loading Buffer購自大連寶生物公司；大腸桿菌Escherichia coliDH5α菌株由實驗室保存。

1.2 方法

總RNA提取：取0.2 g果皮樣品，按EASYspin植物RNA快速提取試劑盒說明書提取植物總RNA，于－20℃保存備用。

反轉錄：總RNA提取液3.5μL、隨機引物1.0μL、5×M-MLV Buffer 4.0μL、dNTPs 1.0μL、RNA酶抑制劑0.5μL、M-MLV酶0.5μL，加DEPC處理水至20μL，42℃反應1 h，于－20℃保存備用。

PCR：參照郭瑞等報道的檢測ASSVd的正向引物（5′-CCGGTGAGAAAGGAGCTGCCAGCA-3′）和反向引物（5′-CCTTCGCCTTCGTCGACGACGACAGGTGAGT-3′）［9］進行PCR，體系為cDNA 1.5μL、10×Buffer 2.5μL、dNTPs 0.5μL、正向引物0.5μL、反向引物0.5μL、Taq酶0.25μL，加ddH2O至25μL。PCR反應條件為94℃預變性3 min；94℃變性30 s，67℃復性30 s，72℃延伸45 s，35個循環，最后72℃延伸10 min。PCR產物約330 bp，經1%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

克隆測序：按DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書回收PCR產物，之后連接到p MD18-T克隆載體上，陽性克隆經驗證后交由華大基因科技股份有限公司進行測序。將所得的序列經MEGA 5.1軟件與GenBank中已報道的具有代表性的ASSVd蘋果分離物序列進行比較分析。

2 結果與分析

圖1 小蘋果樣品癥狀與蘋果銹果類病毒RT-PCR檢測結果Fig.1 Symptoms on small apple fruit and detection of ASSVd by RT-PCR

2.1 RT-PCR檢測

以提取的表現畸形癥狀的小蘋果果實（圖1a左）與健康小蘋果果實（圖1a右）的總RNA為模板，利用檢測ASSVd的引物進行RT-PCR擴增。與陽性對照相比，表現癥狀的樣品獲得了預期大小的目標條帶，而健康樣品則沒有擴增出條帶（圖1b），表明帶有畸形癥狀的小蘋果已被ASSVd侵染。

2.2 序列測定與分析

將RT-PCR擴增得到的約330 bp的片段回收，克隆到p MD18-T載體并進行序列測定。結果表明，該分離物基因組由329個核苷酸組成，具有蘋果銹果類病毒屬中央保守結構序列。利用MEGA5.1軟件構建鄰接法（neighbor joining）系統發育樹，以蘋果凹果類病毒（Apple dimple fruit viroid，ADFVd）作為系統發育分析外群，1 000次循環計算系統樹中節點的自舉置信水平（圖2）。可以看出，ASSVd小蘋果分離物序列（標記為YQ）與來自不同國家和地區的ASSVd蘋果分離物序列之間的親緣關系極近，且與中國北京蘋果分離物（HQ840722）和伊朗蘋果分離物（HQ326094）處在同一分支上，進一步證明了在北京市延慶縣發現的畸形小蘋果被ASSVd侵染。

2.3 二級結構預測

將得到的ASSVd基因組全序列利用CLC RNA Workbench 4預測二級結構（圖3），分析后發現ASSVd小蘋果分離物的中央保守區（CCR）與末端保守區（TCR）與ASSVd其他分離物是完全一致的。

圖2 ASSVd部分分離物系統發育樹Fig.2 Phylogenetic relationship of some ASSVd isolates

圖3 ASSVd小蘋果分離物二級結構預測圖Fig.3 Secondary structure prediction of ASSVd isolated from small apples

3 討論

我國早些年在小蘋果上發現了銹果病，但是危害不嚴重，并沒有引起重視，隨著‘國光’品種的引入和種植，銹果病逐漸引起了人們的重視［10］。迄今為止，ASSVd已在不同種類的果樹上被檢測到，如‘富士’蘋果、杏和桃等，其寄主范圍在擴展［1-5，9］。近幾年通過調查和檢測，我們發現ASSVd在我國蘋果主產區發生率逐年提高，如不采取措施積極防控，將對我國蘋果生產造成嚴重危害。在2013年的調查中，發現了果實畸形的小蘋果，經檢測和序列克隆分析，證實ASSVd侵染了在我國北方冷涼地區廣泛種植的小蘋果，這是對ASSVd侵染小蘋果的首次檢測和鑒定。本研究中ASSVd小蘋果分離物的CCR和TCR與ASSVd其他分離物完全一致，有研究表明CCR和TCR與類病毒的復制密切相關［11-12］。小蘋果由海棠［M.prunifolia（Will.）Borkh］和大蘋果雜交而來，ASSVd能否侵染海棠還有待于調查和證實。

蘋果銹果類病毒侵染蘋果后引起的癥狀在不同的品種上有不同的表現，主要有銹果和花臉兩種類型。本研究中ASSVd在小蘋果上的癥狀主要表現為畸形和著色不勻，這可能是在小蘋果這一特有品系上的表現，也可能是與其他病毒復合侵染引起的。

我國東北地區氣候寒冷，耐寒性極強的小蘋果在當地的蘋果生產與育種中都占有非常重要的地位，生產面積約10萬hm2［8］。鑒于ASSVd的嚴重危害性和傳播性，應密切關注其在小蘋果栽培生產中的危害，在今后的病害流行研究、防治與種質資源保護中都應該給予重視。

［1］ Puchta H，Luckinger R，Yang X，et al.Nucleotide sequence and secondary structure ofApplescar skin viroid（ASSVd）from China［J］.Plant Molecular Biology，1990，14（6）：1065 1067.

［2］ Kyriakopoulou P E，Hadidi A.Natural infection of wild and cultivated pears withApplescar skin viroidin Greece［J］.Acta Horticulturae，1998，472：617 625.

［3］ 趙英，牛建新.新疆桃樹上蘋果銹果類病毒（ASSVd）的檢測與全序列分析［J］.果樹學報，2008，25（2）：274 276.

［4］ Zhao Y，Niu J X.Apricot is a new host ofApplescar skin viroid［J］.Australasian Plant Disease Notes，2008，3（1）：98 100.

［5］ Walia Y，Dhir S，Bhadoria S，et al.Molecular characterization ofApple scar skin viroidfrom Himalayan wild cherry［J］. Forest Pathology，2012，42（1）：84 87.

［6］ King A M Q，Adams M J，Carstens E B，et al.Virus taxonomy：classification and nomenclature of viruses.Ninth report of the international committee on taxonomy of viruses［M］.London：Elsevier Academic Press，2012：1367 1368.

［7］ Hashimoto J，Koganezawa H.Nucleotide sequence and secondary structure ofApple scar skin viroid［J］.Nucleic Acids Research，1987，15（17）：7045 7052.

［8］ 劉延杰，王成軍，王寶霞，等.東北寒地小蘋果生產現狀及存在問題［J］.北方園藝，2013（19）：180 182.

［9］ 郭瑞，李世訪，董雅鳳，等.蘋果銹果類病毒遼寧分離物的克隆與序列分析［J］.植物病理學報，2005，35（5）：472 474.

［10］王煥玉，田常富，劉福昌.談蘋果銹果病的發生和防治［J］.植物保護，1963，1（3）：125 126.

［11］Baumstark T，Schr?der A R，Riesner D.Viroid processing：switch from cleavage to ligation is driven by a change from a tetraloop to a loop E conformation［J］.The EMBO Journal，1997，16（3）：599 610.

［12］Gas M E，Hernández C，Flores R，et al.Processing of nuclear viroids in vivo：an interplay between RNA conformations［J］. PLoS Pathogens，2007，3（11）：1813 1826.

Detection and full sequence analysis ofApple scar skin viroidin small apples

Hao Lu， Ye Ting， Wang Shaojie， Guo Liyun， Fan Zaifeng， Zhou Tao
（Department of Plant Pathology，China Agricultural University，Beijing100193，China）

Small apples are hybrid generations of cold-resistant crabapple cultivars and big apples.Because of their strong endurance under cold and good taste，small apples are widely used as grafting and breeding materials，and are precious germplasm resources in cold regions in our country.Apple scar skin viroid（ASSVd）causes serious damage on apple fruits and huge economic loss.During a survey of apple virus disease in 2013，some small apples with typical malformation symptoms were found in Yanqing County，Beijing.RT-PCR and sequencing showed that those small apples were infected by ASSVd.The full nucleotide sequence of this isolate（ASSVd-YQ）comprises 329 nucleotides.Phylogenetic analysis showed this isolate had close evolution relationship with other isolates reported in different countries and regions.Secondary structure prediction showed that the central conserved region（CCR）and terminal conserved region（TCR）were identical to the reported ASSVd reference sequence.This is the first isolation and identification of ASSVd in small apples.

Apple scar skin viroid； small apples； molecular detection； sequence analysis

S 432.1

A

10.3969/j.issn.0529 1542.2015.01.024

2014 01 02

2014 04 09

國家現代蘋果產業技術體系（CARS－28）；公益性行業（農業）科研專項（201203076－02）

*通信作者 E-mail：taozhoucau@cau.edu.cn