銅綠麗金龜對植物源揮發物的觸角電位和行為反應

謝明惠， 陳浩梁， 衣建坤， 李克斌， 張 杰， 蘇衛華*

（1.中國農業科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；

2.安徽省農業科學院植物保護與農產品質量安全研究所，合肥 230031）

銅綠麗金龜對植物源揮發物的觸角電位和行為反應

謝明惠1，2， 陳浩梁2， 衣建坤1， 李克斌1， 張 杰1， 蘇衛華2*

（1.中國農業科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；

2.安徽省農業科學院植物保護與農產品質量安全研究所，合肥 230031）

為篩選適宜的銅綠麗金龜植物源引誘劑，利用觸角電位（EAG）和Y形嗅覺儀技術，測定了銅綠麗金龜雌、雄蟲對20種植物源揮發物的電生理和行為反應。結果表明：在10μg/μL濃度下，銅綠麗金龜對甲基庚烯酮、順-3-己烯乙酸酯、壬醛、1-辛烯-3-醇、芳樟醇和反-2-己烯醇具有較強的觸角電位反應，且呈雌蟲大于雄蟲的趨勢。Y形嗅覺儀行為測定中，雌蟲對多數揮發物的敏感度高于雄蟲。其中反-2-己烯醇、順-3-己烯乙酸酯、甲基庚烯酮和1-辛烯-3-醇對銅綠麗金龜雌蟲的吸引作用顯著高于對照；而雄蟲僅對順-3-己烯乙酸酯有顯著的趨向選擇。本研究為開發有效的銅綠麗金龜田間引誘劑用于生態治理提供依據。

銅綠麗金龜； 植物源揮發物； Y型嗅覺儀； 觸角電位技術； 行為反應

銅綠麗金龜（Anomala corpulentaMotschulsky）屬鞘翅目，麗金龜科，是我國地下害蟲的優勢種之一［1］。成蟲取食榆樹、楊樹、柳樹、葡萄、月季等花木的葉片，危害林果木生長；幼蟲俗稱蠐螬，為害農作物根、莖部，造成不同程度的減產［2-4］。蠐螬長期生活在土壤中，隱蔽性強且分布廣，防治難度較大，在實際生產中，主要依賴化學農藥進行防治，但容易產生食品和環境安全性問題。因此，采用“幼蟲為害，防治成蟲”是防治此類地下害蟲的有效手段之一［1］。

植物揮發性物質在昆蟲對寄主植物的定向定位、取食、產卵等行為活動中起著重要的作用，這也是昆蟲在長期進化中對環境逐漸適應的結果［5-6］。例如：十字花科植物釋放的揮發物芥子油對小菜蛾（Plutella xylostellaLinnaeus）取食、產卵有引誘作用［7-8］；鞘翅目中為害松樹的天牛科、小蠹科及郭公甲科的甲蟲對松針中單萜成分α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、莰烯和蒈烯有趨向性［9］；許多葉甲科昆蟲利用寄主植物的揮發物作為嗅覺信號，協同其他信號搜尋和定位寄主［10］。昆蟲利用植物氣味的化學指紋圖譜進行特異性識別，是搜尋寄主植物的重要信號。

國內外有關金龜子類引誘劑的相關研究也有報道。Imai等發現寄主植物薔薇（Rosaspp.）花中主要揮發物成分2-苯乙酯對黃綠單爪鰓金龜（Hoplia communisWaterhouse）的引誘作用最強［11］。歐洲庭園麗金龜（Phyllopertha horticolaLinnaeus）對花的揮發物成分順-3-己烯醇、丁子香酚、香葉醇和鄰氨基苯甲酸甲酯敏感［12］。藥用蒲公英（Taraxacum officinaleWeber）揮發物中的順-3-己烯乙酸酯、苯甲醛、苯乙醛、苯甲醇、苯乙醇、苯乙腈、苯甲酸芐酯對扁綠異麗金龜（Anomala octiescostataBurmeister）具有明顯引誘作用，與性誘劑結合使用可提高對雄蟲的誘捕量［13］。丙酸苯乙酯+丁子香酚+香葉醇（3∶7∶3）中加入性信息素japonilure［（R，Z）-5-（1-decenyl）dihydro-2（3H）-furanone］，這種復合物對日本麗金龜（Popillia japonicaNewman）的引誘作用明顯提高，已用來田間監測并商業化出售［14］。李為爭等發現銅綠麗金龜成蟲對蓖麻表現出明顯的趨性，但是這種趨向的目的并不是取食，之后對蓖麻源引誘劑進行了配方篩選和田間效果評價［15-16］。本研究參考相關研究，選取已有文獻報道的寄主揮發物成分和對金龜甲類有引誘作用的化合物，通過觸角電位及行為分析，篩選出有效化合物，為開發田間引誘劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試昆蟲

供試銅綠麗金龜雌、雄成蟲于2012年6月采自合肥市肥西縣董崗鄉，采集后將其分別飼養于塑料盒內（60 cm×50 cm×40 cm）中，盒頂罩紗網，盒底鋪約20 cm厚的潮濕細土（過20目篩），土壤含水量為18%～20%，飼喂新鮮楓楊樹葉，在室內條件下（25℃）飼養。每次試驗選擇健康成蟲進行觸角電位和行為測試。

1.1.2 供試藥劑及其配制

氣味化合物標準品信息如表1，以色譜級正己烷為溶劑，將表中氣味物質配制為10μg/μL的正己烷溶液，待用。

表1 供試化合物的名稱、CAS號、純度及來源Table 1 Sources，purity，CASand names of test compounds

1.2 試驗方法

1.2.1 觸角電位測定

觸角處理方法參照鄧思思等［17］的方法略加改動，使用PRG-2型金屬電極替代玻璃電極連接銅綠麗金龜的觸角。取健康活潑的銅綠麗金龜成蟲，用小鑷子捏住觸角基部至鰓片張開，快速拔下觸角，用刀片切除基部2～3 mm后，利用導電膠粘于電極上。

所用昆蟲觸角電位圖儀（Syntech）由刺激氣體控制裝置CS-55、顯微操作臺MP-15、雙通道USB接口采集控制器IDAC-2和顯示輸出裝置組成。測定時取待測溶液10μL均勻滴加于濾紙條（4 mm× 50 mm），縱向對折后放入進樣管中。每個樣品雌、雄蟲各測試6個觸角，每個觸角測試3次，試驗以反-2-己烯醛的EAG反應值作為參照，以正己烷溶液作為對照。持續氣流和刺激氣流均為500 mL/min，刺激時間為0.5 s，兩次刺激間隔時間不少于1 min。

1.2.2 嗅覺反應測定

選取EAG反應相對值較大的10種化合物進行Y形嗅覺儀測定。自制Y形嗅覺儀內徑4 cm，主臂長40 cm，兩側臂長均為30 cm，兩者夾角為60°。載氣由大氣采樣儀泵入，流量設為500 mL/min，空氣經過活性炭過濾和空氣加濕后進入Y形管，各部件之間用硅膠管連接。Y形管兩臂分別與放有樣品（10μg/μL）和對照正己烷濾紙條的樣品瓶連接。試驗測定在室溫25℃左右，金龜子活動期20：00以后進行。整個試驗保持黑暗環境，并使用紅色光源觀察以避免光對金龜子活動的干擾。將銅綠麗金龜成蟲放在主臂入口，使其頭部朝向兩側臂，觀察成蟲的選擇反應。若金龜子在5 min內沿主臂進入任一側臂內超過5 cm，并停留30 s以上，則視為有選擇；若停留在主臂則視為無反應。每種揮發物測試10頭成蟲，重復6次。每一次測試完后交換左右臂位置，測試完2頭更換濾紙條，測試完一組更換Y形管。Y形管及時用丙酮和蒸餾水沖洗，并烘干。

1.3 數據處理

供試化合物的觸角電位反應相對值參照，具體如下：

式中：Sr為刺激樣品的觸角電位反應的相對值；Sc為刺激樣品的觸角電位反應值；CKm為刺激樣品測定前后正己烷對觸角電位反應值的平均值；Rm為測定刺激樣品觸角電位前后參照的標準化合物觸角電位的平均值。

所有數據統計分析均利用SPSS 17.0進行處理。EAG反應的相對值采用Duncan’s多重比較法進行差異顯著性比較，雌、雄成蟲對同一化合物的EAG反應差異檢驗用t測驗；銅綠麗金龜在嗅覺反應中對測試氣體及空白對照間的選擇性差異分析采用卡方檢驗。

2 結果與分析

2.1 銅綠麗金龜對揮發物的EAG反應

銅綠麗金龜對供試揮發物的EAG反應相對值及顯著性分析見表2。從總的測定結果來看，引起銅綠麗金龜EAG反應相對值較大的揮發物依次為：甲基庚烯酮（213.62%）、順-3-己烯乙酸酯（210.21%）、壬醛（179.75%）、1-辛烯-3-醇（164.12%）、芳樟醇（162.07%）和反-2-己烯醇（153.78%）。表中EAG反應相對值低于100%表示該揮發物的EAG反應值低于參照化合物反-2-己烯醛。銅綠麗金龜對α-蒎烯的EAG反應值最小，反應相對值僅為9.72%，與對照正己烷相當。

表2 銅綠麗金龜對揮發物的EAG反應相對值1）Table 2 Relative EAG values ofAnomala corpulentato volatiles

續表2 Table 2（Continued）

通過銅綠麗金龜雌、雄成蟲對各氣味物質EAG數據的對比可以看出，銅綠麗金龜雌蟲對大部分供試氣味物質的EAG反應相對值略高于雄蟲。如圖1所示，在試驗測定的20種揮發物中，銅綠麗金龜雌、雄蟲對14種揮發物的EAG反應相對值存在顯著性差異，其中雌蟲對11種揮發物的EAG反應相對值大于雄蟲。雌蟲對反-2-己烯醇、芳樟醇、甲基庚烯酮的反應相對值較大，均在200%以上；而引起雄蟲反應相對值較大的揮發物依次為順-3-己酰乙酸酯、甲基庚烯酮、1-辛烯-3-醇。從圖中可以看出，反-2-己烯醇、芳樟醇、2-乙基己醇在雌、雄蟲間的差異較為顯著，其雌、雄蟲的EAG反應相對值比值約為18∶1、11∶1、3∶1。

2.2 銅綠麗金龜對揮發物的選擇反應測定

綜合比較銅綠麗金龜雌、雄蟲對10種揮發物的選擇反應，發現雌蟲對多數揮發物的敏感度高于雄蟲。從圖中可以看出，反-2-己烯醇、順-3-己酰乙酸酯對銅綠麗金龜雌蟲的吸引作用高于對照，且差異極顯著；甲基庚烯酮、1-辛烯-3-醇對雌蟲也有顯著的吸引作用，但雌蟲對辛醛、庚醛的趨向性顯著低于對照；而雄蟲僅對順-3-己酰乙酸酯有顯著的趨向選擇，對其他9種揮發物沒有顯著的趨向選擇性。

圖1 銅綠麗金龜雌、雄蟲對揮發物的EAG反應相對值Fig.1 Relative EAG values ofAnomala corpulentato volatiles

3 討論

植物揮發物中含有數十種甚至上百種的化學物質，然而這其中只有一小部分關鍵化合物對昆蟲的行為起決定性作用［18］。鄧思思等研究發現華北大黑鰓金龜對順-2-己烯醇、反-2-己烯醇、順-3-己烯乙酸酯、辛醛和苯乙醇有較強的電位反應［17］。蘋毛麗金龜對順-3-己烯醇、香葉醇、茴香腦和丁子香酚有明確的EAG反應和行為反應［19］，而本研究中銅綠麗金龜對甲基庚烯酮、順-3-己烯乙酸酯、壬醛、1-辛烯-3-醇、芳樟醇和反-2-己烯醇具有較強的觸角電位反應，對試驗中其他揮發物反應一般，但對α-蒎烯的反應和華北大黑鰓金龜一致，都為最小值，僅與對照相當。這說明不同金龜子對氣味的選擇性有相似點，但也存在種間差異。

圖2 銅綠麗金龜對10種氣味物質的行為反應Fig.2 Behavioral responses ofAnomala corpulentato ten plant volatiles

不同性別的昆蟲在尋找寄主、繁殖后代等行為中所起的作用不同，反映出雌、雄成蟲的觸角感受器可能存在與性別有關的數量、分布上的差異或存在嗅覺生理方面的差異，導致其對氣體的敏感性存在性別差異［20-21］。銅綠麗金龜成蟲觸角感受器的超微結構觀察也顯示，雌雄間感受器種類無明顯差別，但在分布和數量上有差異［22］。本研究中，銅綠麗金龜雌蟲對大多數植物源揮發物的敏感度高于雄蟲，這與前人的研究結果一致［17，23］。陳展冊等人發現綠盲蝽雌蟲對植物揮發物更敏感，而雄蟲對性信息素類似物比雌蟲更敏感［24］。這可能與雌蟲在繁殖后代過程中需要大量取食補充營養，以及尋找合適的產卵地有關。

反-2-己烯醇是常見的“綠葉氣體”，也是植物揮發物的常見組分，對多種昆蟲均有較強的引誘作用［17，24-25］。嗅覺行為測定中，反-2-己烯醇對銅綠麗金龜雌蟲也有明顯的吸引作用，但對雄蟲的引誘作用不顯著，這可能與雌、雄蟲的取食特性相關。Dickens認為最常見的綠葉氣味物質1-己醇、反-2-己烯醇、順-3-己烯醇及其衍生物對昆蟲信息素具有廣泛的增效作用［26］。因而，進一步研究信息素和植物源引誘劑互作可以提高防治的綜合效果［13］。順-3-己烯乙酸酯對華北大黑鰓金龜也有較強的引誘作用［17］，茶尺蠖絨繭蜂對其也有較強的EAG反應［27］。在本試驗中，順-3-己烯乙酸酯對銅綠麗金龜雌、雄蟲均有較顯著的室內引誘效果，但還需要進一步的田間試驗驗證。銅綠麗金龜對蓖麻中含有的芳樟醇、α-松油醇未見明顯的趨向行為［28］。

植物源揮發物和性信息素在銅綠麗金龜成蟲尋找寄主、求偶、產卵過程中具有綜合作用［29］。性別差異、是否交配、營養需求度等都決定昆蟲對氣味的趨向行為。雄蟲通過感受雌蟲釋放的性信息素對雌蟲進行定位并搜索尋找，以期獲得優先交配權；雌蟲繁衍后代的使命使其對植物揮發物較為敏感［24］。試驗中也發現，銅綠麗金龜雌蟲在產卵期對氣味敏感度增加，晚上活動期比雄蟲活躍。本試驗篩選出對銅綠麗金龜成蟲具有引誘作用的揮發物，為開發田間引誘劑提供理論依據，但是銅綠麗金龜成蟲在交配、產卵前后對氣味的趨向選擇性、引誘劑的田間實際應用、引誘劑與性信息素互作關系等方面有待進一步的研究。

［1］ 羅宗秀，李克斌，曹雅忠，等.河南部分地區花生田地下害蟲發生情況調查［J］.植物保護，2009，35（2）：104 108.

［2］ 吳孔明.植保科技創新與病蟲防控專業化—中國植物保護學會2011年學術年會論文集［M］.北京：中國農業科學出版社，2011：169 172.

［3］ 吳繼紅，王共強.危害梨的金龜子及其防治［J］.落葉果樹，2005（6）：56.

［4］ 姚慶學，張勇，丁巖.金龜子防治研究的回顧與展望［J］.東北林業大學學報，2003，31（3）：64 66.

［5］ Cha D H，Powell T H Q，Feder J L，et al.Identification of host fruit volatiles from three mayhaw species（CrataegusseriesAestivales）attractive to mayhaw-originRhagoletis pomonellaflies in the southern United States［J］.Journal of Chemical Ecology，2011，37（9）：961 973.

［6］ 杜家緯.植物 昆蟲間的化學通訊及其行為控制［J］.植物生理學報，2001，27（3）：193 200.

［7］ Hawkes C，Coaker T H.Factors affecting the behavioural responses of the adult cabbage root fly，Delia brassicae，to host plant odor［J］.Entomologia Experimentalis et Applicata，1979，25：45 58.

［8］ Verkerk R H J，Wright D J.Multitrophic interactions and management of the diamondback moth：a review［J］.Bulletin of Entomologic Research，1996，86：205 216.

［9］Chenier J V R，Philogene BJR.Field responses of certain forest coleopteran to conifer monoterpenes and ethanol［J］.Journal of Chemical Ecology，1989，15（6）：1729 1745.

［10］程彬，孫曉玲，孔祥波，等.葉甲科昆蟲的定殖機制［J］.生態學報，2010，30（14）：3901 3911.

［11］Imai T，Maekawa M，Tsuchiya S，et al.Field attraction ofHoplia communisto 2-phenylethanol，a major volatile component from host flowers，Rosaspp.［J］.Journal of Chemical Ecology，1998，24（9）：1494 1497.

［12］Ruther J.Male-biassed response of garden chafer，Phyllopertha horticolaL.，to leaf alcohol and attraction of both sexes to floral plant volatiles［J］.Chemoecology，2004，14：187 192.

［13］Leal W S，Ono M，Hasegawa M，et al.Kairomone from dandelion，Taraxacum officinale，attractant for scarab beetleAnomala octiescostata［J］.Journal of Chemical Ecology，1994，20（7）：1697 1704.

［14］Klein M G，Tumlinson J H，Ladd T L Jr.Japanese beetle（Coleoptera：Scarabaeidae）：response to synthetic sex attractant plus phenethyl propionate：eugenol［J］.Journal of Chemical Ecology，1981，7（1）：1 7.

［15］李為爭，袁瑩華，原國輝，等.銅綠麗金龜對不同植物葉片的選擇和取食反應［J］.生態學雜志，2009，28（9）：1905 1908.

［16］李為爭，楊雷，申小衛，等.金龜甲蓖麻源引誘劑的配方篩選及田間效果評價［J］.中國生態農業學報，2013，21（4）：480 486.

［17］鄧思思，尹姣，曹雅忠，等.華北大黑鰓金龜對20種植物源揮發物的電生理和行為反應［J］.植物保護，2011，37（5）：62 66.

［18］Tasin M，Backman A C，Coracini M，et al.Synergism and redundancy in a plant volatile blend attracting grapevine moth females［J］.Phytochemistry，2007，68（2）：203 209.

［19］路常寬，王曉勤，張巨山，等.蘋毛麗金龜對植物揮發物成分的觸角電位及行為反應［J］.昆蟲學報，2009，52（12）：1379 1384.

［20］范麗清，嚴善春，程紅，等.光肩星天牛對寄主植物萜烯類化合物觸角活性和電位反應［J］.東北林業大學學報，2012，40（11）：143 146.

［21］金鳳，嵇保中，劉曙雯，等.昆蟲產卵分泌物的產生方式、成分及功能［J］.昆蟲學報，2009，52（9）：1008 1016.

［22］姚永生，原國輝，羅梅浩.銅綠麗金龜成蟲觸角感受器的超微結構觀察［J］.華北農學報，2004，19（3）：96 99.

［23］張尚卿，高占林，黨志紅，等.綠盲蝽對四種揮發性物質的觸角電位和行為反應［J］.華北農學報，2011，26（3）：189 194.

［24］陳展冊，蘇麗，戈峰，等.綠盲蝽對性信息素類似物和植物揮發物的觸角電位反應［J］.昆蟲學報，2010，53（1）：47 54.

［25］郭光喜，劉勇.麥長管蚜和禾谷縊管蚜對小麥植株揮發物及蚜害誘導揮發物的行為反應［J］.昆蟲知識，2005，42（5）：534 536.

［26］Dickens J C，Prestwich G D，Ng CS，et al.Selectively fluorinated analogs reveal differential olfactory reception and inactivation of green leaf volatiles insects［J］.Journal of Chemical Ecology，1993，19（9）：1981 1991.

［27］黃毅，韓寶瑜，唐茜，等.茶尺蠖絨繭蜂對茶梢揮發物的EAG和行為反應［J］.昆蟲學報，2009，52（11）：1191 1198.

［28］張艷玲.蓖麻對華北大黑鰓金龜Holotrichia oblita引誘及毒殺作用的研究［D］.鄭州：河南農業大學，2005.

［29］沈幼蓮，高揚，杜永均.植物氣味化合物與斜紋夜蛾性信息素的協同作用［J］.昆蟲學報，2009，52（12）：1290 1297.

Electroantennographic and behavioral responses ofAnomala corpulentato plant volatiles

Xie Minghui1，2， Chen Haoliang2， Yi Jiankun1， Li Kebin1， Zhang Jie1， Su Weihua2
（1.State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese
Academy of Agricultural Sciences，Beijing100193，China；2.Institute of Plant Protection and
Agro-products Safety，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei230031，China）

To find possible attractants，20 kinds of plant volatiles were chosen for electroantennogram test and Y-tube olfactometer bioassays using both female and maleAnomala corpulenta.The results showed that methyl heptenone，cis-3-hexenyl acetate，nonanal，1-octene-3-alcohol，linalool andtrans-2-hexenol elicited significant EAG responses at the concentration of 10μg/μL；furthermore，the response of females was stronger than that of males.The Y-tube olfactometer bioassays indicated that females were more sensitive to most volatiles than males. Compared with the control，females were attracted bytrans-2-hexenol，cis-3-hexenyl acetate，6-methyl 5-hepten-2-one and 1-octene-3-alcohol，but males were only attracted bycis-3-hexenyl acetate.This study could provide a theoretical basis for developing attractants ofA.corpulentafor ecological management.

Anomala corpulenta； plant volatile； Y-tube olfactometer； electroantennogram； behavioral response

Q 965

A

10.3969/j.issn.0529 1542.2015.01.006

2014 01 27

2014 03 13

公益性行業（農業）科研專項（201003025）；植物病蟲害生物學國家重點實驗室開放基金課題（SKL2012IP07）；安徽省農業科學院科技創新團隊（11C1106）；安徽省農業科學院院長青年創新基金面上項目（14B1150）

*通信作者 E-mail：suwh850@163.com