低成本光鑷裝置在熒光定量檢測中的應用*

唐宏武 曹迪 李誠予 龐代文

(武漢大學化學與分子科學學院 生物醫學分析化學教育部重點實驗室 湖北武漢430072)

1970年，美國科學家Ashkin［1］在試驗中發現，當一束平行激光入射到微米級別的微球上時，激光對微球存在一個沿光傳播方向的推力，之后發現當一束高度會聚的激光束入射到微球上時，對小球有一個指向光強最強處的拉力。結合這兩種現象，Ashkin［2］在1986年發明了光鑷這種微球操縱工具。

最近幾十年來，我國在光鑷技術理論研究和應用方面都有了很大的發展。在學科交叉領域，光鑷光源是單色性優良的激光，可以用于對特定光譜的激發，現在已經發展出光鑷與拉曼光譜結合的光鑷-拉曼光譜探測等新技術［3］。我國現有高校進行光鑷研究的實驗室一般使用專業科研級別的光鑷裝置，其價格較高，使光鑷的教學普及受到很大的限制。我們希望利用國產的正置顯微鏡代替昂貴的進口倒置顯微鏡搭建一個光鑷系統，同時采用光鑷的捕獲光源作為熒光基團的激發光源，通過微球富集靶分子，實現靶分子的定量檢測。因此，激光既是光鑷光源，也是熒光信號的激發光源。DNA檢測在核酸特定序列分析、基因研究和癌癥早期診斷等方面具有十分重要的作用。本實驗以含有64個堿基的人乳頭瘤病毒16的DNA(T-16)為靶DNA分子，通過夾心法將其定量捕獲于微球表面，并通過本實驗裝置對其進行定量檢測。

1 光鑷原理

光鑷又稱單光束梯度力光阱，是利用一束高度會聚的激光生成一個三維的光梯度力阱，對微球進行捕獲和操控的技術，利用的是光與物質之間相互作用的力學效應［4］。對于微米級別的粒子，可以用幾何光學方法來考察其與光的相互作用。我們選取透明的介電小球為模型來闡釋光鑷的基本原理。在這里設介電小球的折射率大于周圍介質折射率。

光子具有動量。當光入射到物體上發生反射或折射時，光將動量傳遞給物體，同時產生壓強，這種壓強稱為光壓，光壓與入射的光強呈正相關關系。對于宏觀物體，這種光壓可以忽略，但是對于微納尺度的粒子，這種光壓的作用非常明顯。

當激光照射到透明微米級粒子上時，光在微球的表面和內部發生反射和折射，分別產生散射力和梯度力。散射力方向與光傳播方向一致，強度正比于光強，梯度力方向指向光強最強位置，與光強的梯度變化成正相關。在平行光束中選取兩條光線a、b說明二維勢阱的原理。實線表示入射光線和折射光線，虛線表示反射光，Fa和Fb分別表示a、b兩條光線對小球的力，F表示合力。如圖1(a)所示，在非勻強光場中，小球的橫向受力指向光強更強處;而在圖1(b)的勻強光場中，小球的橫向受力為0。

二維勢阱由平行光形成，光強在傳播方向上(y方向)沒有梯度，故微球在y方向沒有梯度力來平衡散射力。微球到達光軸依然會沿光軸運動，故單個二維光學勢阱無法完全束縛微球。通常用兩束相對傳播的光束照射微球，使其受到兩個等大反向的散射力，實現捕獲;或是在垂直光軸的平面上放置一個擋板，微球接觸擋板后彈力與散射力平衡，也能實現捕獲。

激光在光軸方向具備光強梯度才能產生軸向梯度力來與散射力平衡，以實現單光束梯度力捕獲。通常讓激光束通過透鏡或物鏡，使平行激光高度會聚，獲得軸向光強梯度。這種高度會聚的光束產生的勢阱稱為三維勢阱。圖2為三維勢阱中微球的受力分析。結合圖2，可知微球的中心在會聚光束焦點f的下方或上方，梯度力的合力F的方向均指向焦點位置，當梯度力合力大小與散射力平衡時，微球便可被單光束激光捕獲。

圖1 二維勢阱中微球受力分析

圖2 三維勢阱中微球受力分析

2 三維勢阱的二維捕獲

光鑷的發展經歷了二維光學勢阱到三維光學勢阱兩個階段;形成能完全束縛微球的三維光學勢阱需使用高倍物鏡。而在實際應用中，有時并不需要完全捕獲微球，也不需過高的放大倍數，這時便可使用低倍物鏡，形成一個會聚程度較低的光束來捕獲微球。低會聚光束的軸向梯度力弱，無法平衡軸向散射力，故捕獲微球的過程是先將微球吸入光斑中心，然后將其沿光傳播方向推出，微球在光束的散射力和容器底/頂的彈力的作用下靜止。這種形式類似二維光學勢阱的捕獲，但又是在三維光學勢阱中實現的，故稱其為三維光學勢阱的二維捕獲。

3 光鑷-熒光分析檢測方法

熒光檢測是分析化學中的一種重要檢測手段。近年來，該檢測技術的發展主要體現在兩個方面:一是研究新型的熒光標記物，如熒光蛋白［5］和量子點［6-8］等，二是開發新的熒光檢測方法如流式細胞術［9］和共聚焦熒光顯微鏡等。

本實驗采用的光鑷-熒光分析檢測方法是一種基于單個微球富集待測分子高靈敏度高選擇性的定量分析方法，其檢測對象是微米級的偶聯復合微球。偶聯復合微球是由微球探針偶聯靶DNA后再連接標記有量子點的互補DNA制備得到。熒光的激發需要高能的激發光源，而光鑷的激光光源具有單色性好、能量集中等優點，能滿足熒光激發光源的要求，故可以將光鑷與熒光檢測相結合，檢測被捕獲的微球的熒光。

選用量子點代替傳統的有機熒光染料作為熒光標記物。量子點是一種性能卓越的熒光標記物，具有亮度高、激發光譜寬、發射光譜窄、抗光漂白能力強等一系列優點。由于激光的能量高且集中，需要熒光標記物具有良好的耐光漂特性，量子點滿足實驗要求。并且量子點的一元激發、多元發射的特性也使得多元檢測成為可能。

4 偶聯復合微球的制備

下面以濃度為30nmol/L的靶DNA為例，簡要介紹偶聯復合微球的制備過程。

4.1 微球探針的制備

微球探針的制備分為兩步，先將羧基微球表面修飾上親和素，然后利用生物素-親和素這種高效特異性反應［10］，使微球表面能夠牢固地結合捕獲DNA。移取15μL 50mg/mL直徑大小為3μm的羧基聚苯乙烯微球(阿拉丁，中國)至離心管中，加入100μL 10mmol/L MES緩沖溶液(pH5.0)洗滌兩次。洗滌完畢后，依次加入40μL 1mg/mL親和素(Sigma-Aldrich，美國)，3.6μL 10mg/mL EDC(Sigma-Aldrich，美國)水溶液，室溫條件下，在搖床中培育1.5h后，補加1.8μL 100mg/mL EDC水溶液，繼續培育1.5h，總反應時間為3h。隨后，將表面修飾有親和素的聚苯乙烯微球與30μL 10μmol/L 3'端修飾生物素的捕獲DNA(生工，上海，序列為5'-GTGTGGATAATAGAGAATGTATATCTATGG-Biotin-3')混合均勻，加入100μL 0.01mol/L PBS緩沖溶液(pH7.2)，在微量振蕩器中反應2h，得到微球探針，殘余的捕獲DNA可通過離心的方式除去。最后，將制得的微球探針懸浮于100μL雜交緩沖溶液中(20mmol/L Tris，pH8.0，200nmol/L NaCl)，4℃下保存。

4.2 量子點探針的制備

量子點探針的制備同樣是依據鏈霉親和素-生物素高效特異性結合的原理來反應。依次移取30μL 10μmol/L 5'端修飾生物素的探針DNA(序列為5'-Biotin-ACAGAAAATGCTAGTGCTTATGCAAAT-3')和3.0μL 1μmol/L表面修飾鏈霉親和素的CdSe/ZnS量子點(發射波長605nm，武漢珈源量子點公司)至離心管中混合均勻，然后補加50μL 0.01mol/L PBS緩沖溶液(pH7.2)，在微量振蕩器中反應1h，得到量子點探針，殘余的探針DNA可通過超濾的方式除去。最后，將制得的量子點探針懸浮于50μL雜交緩沖溶液中(20mmol/L Tris，pH8.0，200nmol/L NaCl)，4℃下保存。

4.3 偶聯復合微球的制備

雜交過程采用簡單、快速的一步法雜交反應來實現。將上述制備的微球探針、量子點探針與30μL 1μmol/L目標DNA(T-16，序列為5'-CCATAGATATACATTCTCTATTATCCACACCTGCATTTGCTGCATAA GCACTAG CATTTTCTGT-3')混合均勻，在45℃條件下，在搖床中培育2h后，洗滌兩次，除去殘余的目標DNA。最后，將偶聯復合微球懸浮于100μL雜交緩沖溶液中(20mmol/L Tris，pH8.0，200nmol/L NaCl)，4℃下保存。利用倒置熒光顯微鏡(尼康，ECLIPSE TE2000-U，日本)，以藍光為激發光源拍攝的偶聯復合微球如圖3所示。

圖3 偶聯量子點的復合微球的顯微熒光照片

5 光鑷-熒光檢測裝置的搭建

光鑷裝置通常由激光光源、耦合光路、顯微鏡和移動控制平臺組成。通常加裝CCD或CMOS攝像頭，搭配計算機進行實時圖像記錄。目前國內實驗室所用顯微鏡多為較昂貴的倒置熒光顯微鏡，Stephen P等人提出一種用有限遠正置顯微鏡系統構建光鑷的方法［11］，但該方法非常復雜，不利于教學推廣。我們參考無限遠顯微鏡光鑷的結構，對現有的國產有限遠正置顯微鏡(重慶光學儀器廠)進行改造，拆除光路中的透鏡，僅留下激光通路及光路中的二向色鏡DM，同時將物鏡替換成無限遠物鏡，這樣就將有限遠系統顯微鏡改造為無限遠顯微鏡。本套裝置采用三維勢阱的二維捕獲(以下簡稱二維捕獲)方式捕獲微球，物鏡為無限遠40×物鏡(Olympus NA 0.60)。低倍物鏡透光率較高，可降低激光透過后的功率損失。二維捕獲將微球捕獲到容器底/頂部光斑光強最強處，既可使微球位置穩定，實現最大程度的熒光激發，也可使每個微球的熒光激發條件保持一致。

如圖4所示，光源采用波長473nm，功率0～130mW可調的DPSS激光器(長春鐳仕光電科技有限公司MW-BLN-473)。激光經過L1和L2透鏡組擴束準直后，經DM反射進入物鏡后瞳，經物鏡聚焦成為一束會聚激光，形成光學勢阱，對微球進行捕獲。

捕獲激光同時用于熒光標記物的激發。量子點熒光信號由與顯微鏡結合的光譜儀采集。光譜儀由光柵單色儀(北京光學儀器廠，WDG30)和線陣CCD(日本濱松，S7031-1007)構成。由于雙色分光鏡DM不能完全過濾熒光信號中混有的激光，通過單色儀分光可分離殘余的激光。調整光柵的角度可以將熒光或激光信號聚焦投影到適當的CCD檢測范圍。對于多色量子點熒光信號，可通過光柵分光后分別檢測，此時CCD為多通道檢測器。

6 實驗結果

6.1 微球的捕獲

實驗中所用復合微球的基底為直徑3μm的聚苯乙烯微球。復合微球分散于石英載玻片和石英蓋玻片之間的液膜中，如圖5所示。在實驗過程中，移動二維載物臺使微球靠近光斑，當接近光斑中心時，微球被吸入光斑中心，其后被壓在載玻片的上表面。此時移動載物臺，發現微球相對光斑中心保持靜止，可知微球已被光阱捕獲。

圖4 實驗裝置示意圖

圖5 三維勢阱的二維捕獲示意圖

6.2 單個微球熒光信號的檢測

將顯微鏡明場光源關閉，可觀察到光阱中偶聯復合微球的紅色熒光，再將顯微鏡從目鏡觀察模式切換到信號檢測模式，可從配套軟件界面讀出此時微球的熒光強度值。由圖6可以看出，經過單色儀分光和譜帶位置調整，殘留藍光已被移出CCD的檢測范圍，譜圖中僅剩紅色的量子點熒光信號峰。

6.3 工作曲線和檢出限

用相同的制備方法分別制備2.5、5.0、10.0、20.0和30.0nmol/L 5種不同靶DNA濃度下的偶聯復合微球，利用光鑷-熒光定量檢測裝置檢測，在相同的激光功率激發下，當CCD積分時間為7ms時，測得對應的熒光強度，每種濃度下的熒光強度均為檢測50個不同微球熒光峰的統計平均結果。圖7為6種富集不同濃度靶DNA(即上述5個濃度和空白)的單個復合微球的熒光光譜。結果表明:熒光強度ⅠF與c(T-16)在0～30nmol/L之間呈線性關系(圖8)，隨著靶DNA濃度的增大，偶聯復合微球的熒光強度也隨之升高，ⅠF=2.96c(T-16)+24.72，相關系數為0.9745。通過測量空白樣品，得到本檢測方法的檢出限(3σ，其中σ表示空白樣品的標準偏差，n=11)為1.4nmol/L。實驗表明，方法的靈敏度與CCD積分時間顯著相關，當積分時間為50ms時，方法的檢出限可以降低一個數量級。

7 實驗總結

本實驗利用實驗室現有的國產正置顯微鏡，經過改造，構建了一臺簡易的光鑷裝置，并成功實現了單個微球的二維捕獲。同時利用激光的特性，將熒光檢測技術與光鑷裝置相結合，在實現微球捕獲操縱的同時，對復合微球的熒光進行了定量檢測，測定了熒光強度-靶DNA濃度的工作曲線。由于本實驗對微球的操縱要求不高，故采用了三維光阱的二維捕獲這種捕獲方式，同時也利用了這種捕獲方式不需要高倍物鏡的特點，有效地降低了激光能量的損失，提高了熒光激發強度。量子點具有發射峰窄、耐光漂白等優良特性，因此非常適合作為以激光為激發光源的熒光標記物。

圖6 單色儀分光后測得的光鑷捕獲單個微球的熒光光譜(量子點標記)

圖7 6種富集不同濃度靶DNA的單個復合微球的熒光光譜

圖8 熒光強度-靶DNA工作曲線

本實驗通過對DNA的檢測，成功地對方法的原理和通用性進行了驗證。也可以通過偶聯抗體或DNA適配體等方法來特異性富集血清中腫瘤標志物等分子，用于患者血清生化指標檢查和癌癥診斷等方面，因此本實驗裝置在生物醫學分析領域具有潛在應用價值。

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