ATDC5：一株反映軟骨形成完整過程的細胞系*

馮其帥，高麗娜，崔元璐

ATDC5：一株反映軟骨形成完整過程的細胞系*

馮其帥，高麗娜，崔元璐

（天津中醫藥大學中醫藥研究院，天津300193）

中醫學認為，筋骨失養，系肝腎虛衰所致。補腎中藥的某些有效成分具有與細胞因子、激素類似的生理活性和廣泛的藥理作用，不僅可用于骨性關節炎的治療，而且在組織工程及干細胞工程領域有廣泛的應用前景。ATDC5細胞株來源于小鼠畸胎癌株AT805，作為一個前軟骨細胞株其分化過程與軟骨形成過程類似。在細胞因子、激素和無機磷酸鹽等作用下，ATDC5細胞將發生增殖、聚集進而進入軟骨細胞分化階段，分化為增殖性軟骨細胞。增殖性軟骨細胞隨后繼續分化為肥大性軟骨細胞，從而進入終末分化階段，軟骨基質發生礦化，最終沉積成骨。通過從系統調節因子、局部調節因子和細胞培養條件三個方面，揭示ATDC5細胞增殖、分化與礦化的分子機制，為軟骨發育研究及中藥有效成分高通量篩選提供理論依據。

細胞生物學；補腎中藥；ATDC5細胞；軟骨形成；軟骨細胞

軟骨形成過程始于間充質細胞增殖、聚集，其后逐步地分化為增殖性軟骨細胞，而增殖性軟骨細胞發生肥大化后分化為無增殖活性的肥大軟骨細胞，進而肥大軟骨細胞發生礦化進入終末分化階段，最終被骨組織取代。ATDC5細胞株來源于小鼠畸胎癌株AT805，作為一個前軟骨細胞株其分化過程與軟骨形成過程類似。研究表明，ATDC5細胞增殖、分化以及礦化階段均可受誘導分化因子的影響，從而加速某一階段的進程或者增強某一階段的特征性軟骨基質的表達。在軟骨細胞分化早期，ATDC5細胞通過細胞聚集形成軟骨小結并表達相應的特征性軟骨基質，如聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、Ⅱ型膠原蛋白（Collagen typeⅡ）等。伴隨著軟骨基質發生礦化，ATDC5細胞進入終末分化階段，同時表達Collagen typeⅩ、堿性磷酸酶等標志性產物。研究證明，ATDC5細胞不僅具有穩定地表達軟骨細胞外基質的能力，而且具有較強的增殖能力而便于體外擴增培養。

中醫認為，腎藏精，主骨生髓，髓藏于骨腔內，滋養骨骼［1］。現代藥理學表明，補腎壯骨中藥不僅能夠延緩軟骨的損傷、降解以及退變，而且可以促進軟骨分化與修復［2］。本文將從系統調節因子、局部調節因子和細胞培養條件三個方面，揭示不同調節因子與ATDC5細胞的增殖、分化以及礦化之間的相互關系，為探究補腎壯骨中藥軟骨保護作用的分子機制提供一個展示軟骨形成過程的細胞藥理學模型。

1　系統調節因子

1.1生長激素（GH）/胰島素樣生長因子-1（IGF-1）系統生長激素具有廣泛的生物學功能，其主要表現為具有促合成與生長發育的作用。在軟骨形成過程中，生長激素可以促進軟骨細胞的增殖與分化，調節蛋白質、糖及脂肪的代謝［3］。一般認為，IGF-l通過介導生長激素從而發揮促進骨增長的作用，進而形成了GH/IGF-l功能系統［4］。Koike等［5］對ATDC5細胞進行成纖維細胞生長因子受體-3（FGFR3）突變誘導，MTT實驗結果顯示FGFR3突變的細胞增殖被抑制進而細胞凋亡。進一步研究發現，ATDC5細胞培養過程中加入IGF-1，IGF-1通過絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）信號通路可以促進細胞增殖和抑制細胞凋亡。IGF-1可以介導生長激素對軟骨發育不全患者的治療過程，其機制可能為通過PI3K和MAPK通路抑制FGFR3突變導致的凋亡。此外，生長激素可直接作用于生長激素受體而發揮其調控作用［6］。根據相關報道，ATDC5細胞自身可以表達內源性生長激素受體。利用生長激素誘導ATDC5細胞研究發現，生長激素通過直接作用于生長激素受體誘導STAT5磷酸化促進Collagen typeⅡ的表達從而加速ATDC5細胞早期分化的進程［7］。

1.2甲狀腺素甲狀腺素具有廣泛而復雜的生理作用，尤其對骨骼發育起著至關重要的作用［8］，其中先天甲狀腺素分泌不足將導致侏儒癥發生。3，5，3，-三碘甲狀腺原氨酸（T3）和3，5，3，'5'-四碘甲狀腺原氨酸（T4）是甲狀腺素兩種主要的活性成分。分子生物學研究表明，甲狀腺素能夠靶向作用于軟骨發育調控基因，從而加速軟骨細胞趨向于肥大軟骨細胞分化的進程，促進軟骨基質礦化，最終實現協調軟骨形成過程的作用［9］。Miura等［10］研究發現，T3可以增強茜素紅S染色而對阿利新藍染色無影響，表明T3對ATDC5細胞的作用主要表現為促進終末分化而對早期分化無明顯作用。Siebler等［11］也發現T3可以抑制ATDC5細胞增殖，誘導堿性磷酸酶和Collagen typeⅩ的表達，加速軟骨細胞向成骨細胞分化。在軟骨分化發育過程中，T4可以被激活轉化為T3從而調控軟骨形成。

在軟骨細胞增殖與分化過程中，成纖維細胞生長因子（FGFs）是重要調節因子之一，其中FGFR3基因突變可以引起軟骨發育不全。研究發現，T3通過靶向于FGF/FGFR信號通路中關鍵蛋白HSPGs來調控ATDC5細胞分化發育［12］。在軟骨形成階段，T3能夠激活FGF2和FGF18調控ATDC5細胞的增殖與分化［13］。除此之外，Ihh/PTHrP與甲狀腺素的代謝和其活性成分T3存在著密切的聯系，介導T3調控軟骨形成過程。

1.3雌激素雌激素屬于類固醇激素，靶向于細胞內雌激素受體（ER）發揮作用。雌激素受體是核受體超家族的成員，具有轉錄因子的作用，包括ERα和ERβ兩種亞型［14］。雌激素對骨的作用可能是通過介導調控成骨細胞、成骨細胞前體、骨細胞和生長骨板的軟骨細胞ERα而實現的。為了探討雌激素對ATDC5細胞增殖的影響，Zheng等［15］利用10-11～10-8mol/L雌激素誘導ATDC5細胞，發現雌激素可以促進細胞增殖并且表現出時間和劑量依賴性。進一步研究發現，雌激素的作用機制為促進CNP信號通路中CNP、NPR-B和NPR-C蛋白表達而實現的。在軟骨細胞對數生長期，雌激素與瘦素相輔相成，調控軟骨發育過程。研究發現，在ATDC5細胞中，雌激素與瘦素受體均有表達。雌激素可以通過雌激素受體促進瘦素受體的表達，而瘦素也可以通過ERK信號通路促進雌激素受體的表達，從而加速ATDC5細胞肥大化過程，促進其分化為成骨細胞［16-17］。

1.4骨保護素骨保護素是一種骨代謝過程的中介分子，介導多種細胞因子和激素對破骨細胞分化與活化的負性調節作用［18］。骨保護素是核因子（NF）NF-κB受體活化因子配體（RANKL）的假受體，具有高度的RANKL親和力。通常認為，骨保護素以競爭性結合的方式抑制核因子κB受體活化因子（RANK）與RANKL的結合，阻斷級聯反應從而抑制破骨細胞的形成以及骨吸收［19］。在ATDC5軟骨分化過程中，骨保護素和RANK兩者均可以表達，兩者相互結合從而抑制RANK的表達，進而抑制ATDC5細胞趨向破骨細胞分化而促進其增殖與分化［20］。

1.5糖皮質激素糖皮質激素是人體在生理狀態下分泌的［21］。在關節炎治療中，地塞米松、氫化可的松、潑尼松等糖皮質激素作為抗炎藥物經常被使用。在治療過程中，發現地塞米松能夠抑制骨骼發育，尤其是抑制軟骨細胞的增殖。同樣研究表明，地塞米松可抑制ATDC5細胞增殖和蛋白多糖的合成，其抑制蛋白多糖的機制是通過調控PI3K/Akt信號通路從而抑制Runx2轉錄因子實現的［22］，而抑制細胞增殖的機制是通過誘導細胞自噬而實現的［23］。

1.6胰島素胰島素與IGF-I相類似，具有異二聚體α2 β2蛋白結構以及相似的下游信號通路和受體靶點。兩者均可通過胰島素受體（IR）、IGF-IR和IR/IGF-IR結合發揮其調節軟骨細胞增殖和分化的作用。Yao等［24］使用分別含有分化因子、生長因子和胰島素的細胞培養基對ATDC5細胞進行培養，觀察不同誘導分化因子對軟骨細胞分化發育的影響。實驗結果表明，3種細胞培養基均可以促進ATDC5細胞的增殖，其中以含有胰島素的細胞培養基作用最為顯著。此外，含有分化因子的細胞培養基可顯著地增強軟骨細胞分化特征性基質的表達，而含有胰島素的細胞培養基可以促進軟骨細胞礦化特征性基質的表達。重要的是ATDC5細胞在含有胰島素的細胞培養基中培養時，其總糖胺聚糖表達量是最高的。胰島素對ATDC5細胞的作用主要表現為促進細胞增殖和加速軟骨細胞功能的表達。

2　局部調節因子

2.1轉化生長因子-β（TGF-β）在軟骨形成過程中，TGF-β通過激活經典與非經典的Smad通路調節軟骨特定功能蛋白的基因表達，涉及到軟骨細胞聚集、增殖、細胞外基質合成以及礦化等各個階段［25］。在軟骨細胞分化早期，TGF-β以激活Smad 3與轉錄因子形成復合物的方式，募集CREB/p300到Collagen typeⅡ啟動子上從而增強其表達。在ATDC5細胞中研究發現，TGF-β主要通過兩種方式實現對ATDC5細胞誘導分化作用：一方面通過Smad 3從而啟動軟骨基質的表達。另一方面通過p38/ERK1/2通路維持軟骨基質長期的表達。Watanabe等［26］對TGF-β誘導ATDC5細胞軟骨基質表達的作用及其機制進行了研究。結果表明，在細胞培養基中添加TGF-β，可迅速地促進ATDC5細胞中蛋白聚糖的表達。分子機制研究發現，無論處于增殖期還是分化期，TGF-β對蛋白聚糖的誘導作用均由ERK1/2和p38 MAPK信號通路所介導。Han等［27-28］對增殖期ATDC5細胞給予TGF-β1誘導，培養12 d后，蛋白聚糖和Collagen typeⅡ的表達均顯著上調，并具有時間、依賴性。在ATDC5細胞中，TGF-β1可以調控SRp40的表達從而促進纖維蛋白表達，纖維蛋白通過RGDS多肽調控蛋白聚糖和多功能蛋白聚糖之間的平衡［29］。

2.2骨形態發生蛋白（BMPs） BMPs屬于TGF-β超家族，是一類具有促軟骨形成作用的內源性蛋白。處于不同分化階段的ATDC5細胞將表達不同類型的內源性BMPs。其中，BMP-2在軟骨細胞分化各個階段均可以表達；BMP-6在軟骨小結形成階段表達上調；BMP-7在細胞鈣化階段才可以被檢測到［30］。

作為誘導成骨細胞分化重要的細胞外信號分子之一，BMP-2是軟骨形成過程中間充質細胞分化所必需的調節因子，其發揮作用主要涉及到兩條信號通路：BMP-2/Smads/Runx2/Osterix信號通路和BMP-2/Smads/Msx2/Osteri信號通路［31］。Shukunami等［32］研究發現，BMP-2上調Collagen typeⅩ和ALP基因表達同時下調Collagen typeⅡ基因的表達，從而促進ATDC5細胞分化為肥大軟骨細胞。體外實驗發現，BMP-7可以促進軟骨細胞外基質合成進而促進軟骨細胞早期分化［33-34］。Caron等［35］將BMP-7與BMP-2以微克級濃度誘導處于分化期ATDC5細胞，分析BMP-7與BMP-2對ATDC5細胞差異性作用。實驗結果顯示，BMP-2可以促進ATDC5細胞Collagen typeⅩ、ALP、Runx2和MMP-13等軟骨細胞肥大化特征性產物的表達，而BMP-7促進軟骨細胞分化特征性基因Aggrecan、Collagen typeⅡ和Sox9的表達而抑制礦化產物的表達。由此表明，BMP-2是肥大軟骨細胞的誘導因子，而BMP-7是增殖性軟骨細胞的誘導因子。

2.3Sox9Sox9作為一個重要轉錄因子，在軟骨細胞早期分化中扮演著極其重要的角色。首先，Sox9與軟骨細胞特異增強子Col2α1結合從而直接調控Collagen typeⅡ表達［36］；其次，L-Sox5、Sox6與Sox9三者能夠形成蛋白復合物，相互協同作用于Col2α1增強子序列從而促進Collagen typeⅡ的表達。Sox9也可以通過結合于PTHrP基因的啟動子區增加PTHrP基因啟動子活性，進而促進軟骨細胞增殖和分化［37］。此外，Wnt/β-catenin和TGF-β/Smad信號通路通過調控Sox9從而參與到軟骨細胞早期分化過程中［38］。

在ATDC5細胞中，存在著一個負責調控Sox9基因表達的含有30個堿基對的增強子。Ushita等［39］研究發現NF-κB RelA可以促進ATDC5細胞表達Collagen typeⅡ，其作用機制為NF-κB RelA靶向結合Sox9增強子，調控Col2a1基因從而促進軟骨基質Collagen typeⅡ的表達。低密度脂蛋白受體相關蛋白（LRP4）是一種Wnt信號通路抑制劑。Asai等［40］對LRP4在ATDC5細胞分化過程中的作用進行了相關研究，結果表明LRP4通過阻斷Wnt/β-catenin信號通路而增強Sox9基因表達而促進軟骨基質Collagen typeⅡ和Aggrecan的表達，促進ATDC5細胞早期分化。

2.4Runx2作為軟骨細胞成熟的調控中心，Runx2已經成為目前研究的熱點。Runx2是軟骨形成過程中沉積階段的特征性產物，在前肥大軟骨細胞和肥大軟骨細胞中表達量顯著上升，而在增生性軟骨細胞中，其表達量明顯下降［41］。在ATDC5細胞中，Runx2的表達量在其肥大化階段、增殖與分化階段顯著增加。Runx2可以通過促進Collagen typeⅩ表達來加速ATDC5細胞向肥大軟骨細胞分化［42］。Runx2在ATDC5細胞成熟過程中發揮著重要的作用。利用siRNA技術干擾ATDC5細胞Runx2的表達，發現肥大化的ATDC5細胞成骨特征性產物的表達降低，減緩軟骨細胞成熟進程［43］。

3　細胞培養條件

3.1無機磷酸鹽在軟骨形成過程中，無機磷酸鹽可以加速增殖性軟骨細胞向肥大性軟骨細胞分化，促進軟骨細胞的成熟以及細胞外基質礦化進程。Magne等［44］利用 CaCl2和 NaH2PO4/Na2HPO4調節ATDC5細胞培養基中無機磷、鈣的濃度，觀察細胞成熟和礦化情況。研究表明，無機磷酸鹽可以增加ATDC5細胞Collagen type X的表達，誘導軟骨細胞發生礦化。此外，無機磷酸鹽也可以通過降低Bcl-2/Bax比值、DNA片段化和激活Caspase-3從而誘導ATDC5細胞凋亡。

3.2維生素C維生素C在骨與軟骨發育過程中發揮著至關重要的作用。對于許多間充質來源的細胞，如脂肪細胞、成骨細胞、成肌細胞和軟骨細胞，維生素C是一種必要的誘導分化因子［45］。維生素C缺乏將導致軟骨細胞增殖緩慢、軟骨基質合成降低以及成骨細胞數量減少。目前，很多研究工作都在ATDC5細胞培養基中加入維生素C，其目的在于促進ATDC5細胞增殖和分化，從而縮短實驗周期［46-47］。在細胞培養基中加入高劑量的維生素C，可使ATDC5細胞軟骨基質Aggrecan、Collagen typeⅡ和Collagen typeⅩ的表達顯著地增加，軟骨細胞增殖與分化階段的時間由21 d縮短為7 d，同時軟骨肥大分化階段也顯著地得到增強［48］。

4　結論

在軟骨形成過程中，軟骨細胞一般需要經歷3個不同分化階段：前軟骨細胞、增殖性軟骨細胞和肥大性軟骨細胞。在誘導分化因子作用下，ATDC5細胞展現出了分化為不同特征性軟骨細胞的潛力。在生長激素、IGF-1、骨保護素、TGF-β、BMP-7和Sox9等調節因子的作用下，ATDC5細胞趨向分化為增殖性軟骨細胞，分化早期階段特征性產物表達升高，其增殖與分化過程得以加快。在甲狀腺素、雌激素、BMP-2、Runx2、無極磷酸鹽等調節因子的作用下，ATDC5細胞趨向分化為肥大化軟骨細胞，進而成熟分化為成骨細胞，分化晚期階段特征性產物表達升高，其礦化與成骨的過程得以加速。

綜上所述，ATDC5細胞可作為一個體外細胞藥理學模型，反映軟骨形成中軟骨細胞增殖、分化與礦化的完整過程，用以篩選具有促軟骨分化發育作用的中藥方劑或中藥的活性成分，便于揭示補腎中藥在軟骨細胞增殖、分化以及礦化各個階段調控作用的分子機制。

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ATDC5:A well-characterized cell line of reflecting a complete chondrogenesis progress

FENG Qi-shuai，GAO Li-na，CUI Yuan-lu
（Research Center of Traditional Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

The malnutrition of bone and muscle is caused by the failure of liver and kidney in traditional Chinese medicine.Some effective components，isolated from nourishing kidney drugs have the widely pharmacological effects，which is similar to cytokines or hormones that are used for osteoarthritis treatment，tissue engineering and stem cell engineering.ATDC5 cell，derived from mouse teratocarcinoma AT805，is characterized as a chondrogenic cell line which goes through a sequential process analogy to chondrogenesis.Under the effects of the differentiation factors，such as cytokines，hormones，inorganic phosphate，etc，ATDC5 cells proliferate，gather and differentiate into proliferating chondrocytes.And then mineralized matrix is produced and proliferating chondrocytes subsequently differentiate into hypertrophic chondrocytes and are gradually replaced by bone.From system regulation factors，local regulation factors and cell culture conditions，this review will reveal the molecular mechanism of proliferation，differentiation and mineralization of ATDC5 cell，which provides the theory basis for cartilage development researches and high-throughput screening of effective components of Chinese traditional medicine.

cell biology；nourishing kidney drugs；ATDC5 cell；chondrogenesis；chondrocytes

R285.5

A

1673-9043（2015）06-0379-06

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.12.16

國家自然科學基金項目（81473542）；教育部高等學校博士學科點專項科研基金（20131210110008）。

馮其帥（1990-），男，碩士研究生，從事中藥藥理學研究。

崔元璐，E-mail:cuily@tju.edu.cn。

（2015-08-19）