反向代謝工程研究進展

周筱飛，陳婷婷，田　野，黃　敏，施碧紅,2

(1.福建師范大學生命科學學院，福建　福州　350108；2.福建師范大學工業微生物教育部工程研究中心，福建　福州　350108)

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反向代謝工程研究進展

周筱飛1，陳婷婷1，田野1，黃敏1，施碧紅1,2

(1.福建師范大學生命科學學院，福建福州350108；2.福建師范大學工業微生物教育部工程研究中心，福建福州350108)

摘要：反向代謝工程通過構建具有遺傳多樣性的突變文庫，結合有效的高通量篩選技術，從而獲得由多基因控制的復雜表型。目前，它已成為工業生物技術中研究生物代謝途徑和改造菌株性能的強有力工具。反向代謝工程研究中的一個瓶頸問題是如何獲得多樣化的細胞表型突變庫，該文介紹了幾種經典的和近期發展起來的解決該瓶頸問題的方法，并列舉了這些方法的最新應用進展。

關鍵詞：反向代謝工程；突變庫；細胞表型；高通量篩選

生物的代謝途徑是一個復雜的網絡結構，細胞的表型與基因型之間并非是線性對應關系，往往多個基因共同控制著細胞的某一特定表型[1]。傳統的代謝工程育種方法以代謝分析和代謝改造為主，主要依賴于對單個或多個特定基因進行敲除或過量表達。在具體的實踐中常采用削弱已有的代謝途徑、擴展已有的代謝途徑及構建新的代謝途徑等方法，但是這些方法很大程度上僅僅是應用分子生物學的某種表現形式，且采用這些方法對菌株進行成功改造的一個先決條件是對某一代謝產物或特定表型產生的生化途徑有清晰的認識。鑒于細胞代謝系統的復雜性，以及目前人們對細胞代謝網絡認識的局限，利用傳統方法的育種結果往往并不理想[2]。20世紀80年代以來，包括基因組、轉錄組、蛋白質組、代謝組等組學技術的快速發展極大的促進著代謝工程的發展和應用，使人們開始在系統水平上更加全面的評估細胞表型，并催生了一種新的代謝設計策略——反向代謝工程(Inverse metabolic engineering，IM，也稱逆代謝工程)[3-4]。這是一種利用基因組學理論，采用逆向思維方式進行代謝設計的新型代謝工程，整體思路是，先在異源生物或相關模型系統中，通過計算或推理確定所希望的表型，然后確定決定該表型的基因或特定的環境因子，最后通過基因改造或環境改造使該表型在特定的生物中表達[5]。

反向代謝工程可以使人們快速的實現“表型—基因型—表型”一體化的基因重組策略，是現代工業生物技術中進行代謝途徑研究及菌株改造的強有力工具。反向代謝工程研究中的一個主要瓶頸問題是如何獲得目的表型的突變庫，在其發展的幾十年間，研究者已經開發了實施該策略的多種方法，本文介紹了其中的幾種主要方法及其原理，總結并評述了這些方法的應用及進展。

1傳統反向代謝工程技術

傳統的反向代謝工程技術包括自發突變、物理化學誘變及轉座突變等[6]。自發突變的現象早在上千年前就被人類加以利用，近年來已有不少利用自發突變介導的反向代謝工程方法所取得的成功報道，如獲得高產1,3-丙二醇的肺炎克雷伯菌株[7]、增強釀酒酵母對木聚糖的利用[8]等。

物理化學誘變是一種經典的選育優良菌株的方法，該技術通過選擇合理的誘變劑，主要對代謝產物合成的某些關鍵基因進行突變，結合有效地篩選策略，獲得性狀優良的目標菌株，但突變的基因并不清楚。物理化學誘變操作簡單，技術要求低，在特定的歷史時期為工業微生物的發展做出了巨大的貢獻，目前我國的工業微生物生產中，仍不少生產菌株是通過誘變育種獲得。周希貴等[9]用亞硝基胍(NTG)對多粘類芽孢桿菌進行誘變處理，篩選到一株粘桿菌素高產突變株。

轉座現象由McClintock在對玉米色斑穩定性研究中首次發現，該發現打破了基因在染色體上線性靜態排列的傳統理論[10]。轉座子是存在于染色體上可以自主復制和移位的基本元件，是介導轉座現象產生的根本原因。利用轉座系統，可以產生包括基因的插入、缺失、顛倒及融合等各種突變。隨機轉座突變技術是最常用的一種分離與克隆基因的轉座策略，利用轉座子可以向整個基因組的任意位點隨機的插入一段基因，使基因突變失活，隨后引起一定的表型變化，在不需要鑒定待測目的基因產物的情況下，即可分離鑒定基因[11]。Ozydin B等[12]利用轉座突變技術向單倍酵母缺失細胞中插入編碼類胡蘿卜合成酶的基因，鑒定出了引起類異戊二烯產量提高的基因缺失，Clancy等[13]也利用該技術成功的確定了鏈球菌編碼輸出蛋白的基因。

2新興發展的反向代謝工程技術

傳統的反向代謝工程技術在工業生產中已經取得了很大的成效，但是鑒于這些方法研究周期長、工作量大且操作存在安全隱患等諸多方面的原因，人們正著力尋找并開發其他有效解決上述問題的新型手段。在轉錄水平上使細胞的基因組發生全局性的改變，可以有效地獲得由多個基因共同控制的復雜目的表型。以下介紹了其中的幾種方法，重點概述了近年來興起的全局轉錄機器工程。

2.1　全局轉錄機器工程

2006年，美國麻省理工大學的Alper等[14]提出了一種對細胞整體的轉錄進行全局性改變的新技術，即全局轉錄機器工程(Global transcription machinery engineering，gTME)。gTME通過對轉錄復合體中的關鍵轉錄元件進行定向進化，結合高通量篩選技術，最終獲得目標性能得到全局強化的優良菌株。理論上，gTME中用作改造對象的轉錄元件有很多，下面簡要介紹基于其中幾種重要元件的全局轉錄機器工程原理及其應用。

2.1.1基于RNA聚合酶的全局轉錄機器工程在全局轉錄機器工程研究中，RNA聚合酶(RNA polymerase, RNAP)是最初的被選作突變的改造對象。眾所周知，基因的轉錄是在RNAP的作用下，以DNA為模板合成mRNA的過程。RNAP是轉錄元件中的關鍵元件，對RNAP的突變可能在全局范圍內引起眾多受控基因轉錄水平的波動，從而發生基因組的全局轉錄重排，篩選出感興趣的細胞表型。

原核生物的RNAP是一個由多種蛋白亞基組成的復合酶，有核心酶(α2ββ′ω)與全酶(α2ββ′ωσ)兩種形式。核心酶只在RNA鏈的延長階段發揮作用，只有在加入σ亞基形成全酶后，DNA的轉錄才會起始。σ亞基能夠特異性地識別并結合在啟動子的-35和-10區，從而激活基因轉錄起始過程[15]。各種微生物的首要σ因子的氨基酸序列均有較保守的區域，序列有著相似性。大腸桿菌的首要σ因子σ70控制著約1000個基因的轉錄表達，σ70的突變能改變RNAP對啟動子的偏好性[16]。Alper等[14]對編碼σ70的rpoD基因進行易錯PCR，建立了一個近106的rpoD基因突變庫，經過高通量篩選，同時快速選育到多個不同優良性狀的突變株，包括乙醇耐受突變株(60 g/L)、SDS耐受突變株、乙醇/SDS雙耐受突變株和高產番茄紅素突變株(7000 g/L)。采用代謝控制育種手段，支鏈氨基酸的產量已經達到某種“飽和”現象，為此，對編碼黃色短桿菌首要σ因子的sigA基因進行隨機突變，初步篩選到多株L-Ile產量提高的突變株，這將對氨基酸生產育種具有重要意義。此外，gTME也被成功應用到真核生物代謝工程中。對釀酒酵母的RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子的TAF25亞基(SPT15)和輔助因子(TAF25)進行定向改造，獲得了一株在6%乙醇條件下生長速率高于對照組13倍的突變株spt15-300[17]。

這是將gTME成功應用到反向代謝工程中的典范，在此之后研究者也對其它的RNAP元件進行了改造，相繼報道過許多成功案例。α亞基與RNAP四聚體的核心(α2ββ′)的形成有關，也可能參與到對相應啟動子的識別與結合中[18]。Klein等[19]通過對大腸桿菌rpoA進行隨機突變，構建了α亞基的隨機突變庫，篩選的結果表明，α亞基的突變同樣能夠促進透明質酸和L-絡氨酸的合成，也能夠提高菌株對丁醇的耐受性。

2.1.2基于CRP的全局轉錄機器工程環磷酸腺苷受體蛋白(cAMP receptor protein，CRP)是一個相對分子質量為42 kDa的同源二聚體蛋白，在原核生物的轉錄調控中發揮重要作用。細胞中以游離形式存在的CRP是沒有調控功能的，當與胞內受體分子cAMP結合后，其自身構象發生一系列變化，從而使其功能得到激活[20]。研究表明，CRP-cAMP復合物調控約400個基因的轉錄表達，它與啟動子的結合是這些基因轉錄起始的必要條件[21]。CRP的全局轉錄效應已被應用到生產實踐中，并取得了很大的成效。

耐滲性是一個由多種基因共同控制的表型，Zhang等[22]利用易錯PCR構建了crp基因的隨機突變文庫，并連接到低拷貝載體轉化大腸桿菌DH5α，經過篩選得到5株對NaCl耐性提高的突變株，隨后以這五個突變株為模板進行DNA改組，最終獲得的突變株在0.9 mol/L NaCl條件下比生長速率為0.113 h-1，大大高于野生菌株。工業發酵中菌株對異丁醇的敏感性大大限制了異丁醇的大量生產，研究表明，全局轉錄因子CRP參與到大腸桿菌對異丁醇的應答反應中，據此Chong等[23]通過構建CRP的隨機突變文庫，選育到了能夠在1.2%異丁醇條件下生長良好的突變株，且突變株的選育周期已由經定向進化的180天縮短至3~5天，這再次證明了全局轉錄在工程育種上的獨特優勢。

2.1.3基于外源轉錄因子的全局轉錄機器工程通常情況下，全局轉錄策略實施的背景是針對同種親緣菌株，即選擇某一菌株自身的全局轉錄因子作為突變對象，最終突變因子的受體仍然是該原始菌株，或是將該菌株改造(物理誘變、化學誘變等)后的突變株。在全局轉錄機器工程發展的近十年中，人們也對此方法及其理論做了進一步的拓展與完善。當前人們已成功的實現了gTME在不同種間的應用，這對某些生物種群所特有的優勢基因，如極端微生物耐受基因的開發與利用具有重大意義。

眾所周知，極端微生物是能適應某些極端環境(如高溫、低溫、高酸、高堿、高鹽、高壓、高輻射等)的特殊種類，因此極端微生物的基因組可以作為某些耐受性狀的基因池[24]。在工業生產中，常常是由于菌株對某些條件(滲透壓、有機溶劑等)的敏感性導致生產的低效率，如果將極端微生物的耐受基因在生產菌中成功表達，很可能使某些生產菌株的耐受性能大大提高，從而提高生產效率。研究表明，irrE是控制耐輻射球菌(Deinococcusradiodurans)的耐高輻射性狀的一個關鍵轉錄因子，它的表達與recA、pprA等的表達，以及過氧化氫酶的活力緊密相關[25-26]。Pan J等[27]克隆了耐輻射球菌的irrE，并讓其在大腸桿菌細胞中表達，發現大腸桿菌的耐滲性能有了一定提高。將野生菌與工程菌進行蛋白質組學分析對比，發現在導入irrE后大腸桿菌細胞中共有124個蛋白的表達發生了改變，這樣大規模的改變可與利用gTME改造菌株后的蛋白改變數量相當，這一點引起了研究者極大的興趣。由于在導入irrE后，除了耐滲性以外，并未發現轉化子其他相關表型的改善，如耐乙醇、耐酸等。考慮到irrE的轉錄調控作用及轉化子的蛋白質改變水平，Chen T等[28]在上述研究的基礎上，構建irrE隨機突變庫，先后在5%乙醇、0.625%丁醇、0.05%醋酸鹽的背景下篩選突變株，分離得到了多株性狀優良的突變株。與包含野生irrE基因的菌株相比，相關突變株的乙醇耐受性、丁醇耐受性、醋酸鹽耐受性分別有了顯著提高。Chen T等的研究表明，耐輻射球菌與大腸桿菌的轉錄調控系統有一定的相似性，外源性的轉錄因子也能夠在新的宿主細胞中發揮轉錄調控功能。這是人們首次將經人工改造后的外源性全局調控因子成功應用到異緣宿主細胞，是對現有的提高菌株耐受性工業育種手段的補充，更是對全局轉錄機器工程的完善。此外，可用作改造對象的轉錄元件還有很多，如H-NS[29]、Hha[30]、β亞基[31]等，這里不作一一贅述了。

全局轉錄機器工程對各種革蘭氏陽性菌與陰性菌、酵母菌等真核微生物等均具有普適性，是反向代謝工程的一種重要新技術。它為工業微生物育種中對菌株進行改造提供了全新的思路與方法，也使得快速高效地獲得具有遺傳穩定性的全局最優表型成為了可能。

2.2　多基因啟動子改組

啟動子是RNAP的識別與特異性結合位點，對啟動子的序列進行突變修飾，可以改變由這類啟動子調控的基因的表達。對啟動子的改變可以從強度與調節功能兩方面著手。研究表明，對某些關鍵酶基因進行過表達或敲除，要么會造成細胞內部負擔過重，引起胞內整體代謝不平衡，要么會影響到其他分支代謝通路的前體物供應，而適度表達則對代謝產物的積累是最有利的。此外，往往多個基因共同控制著代謝途徑中的關鍵限速步驟，使這些基因的表達達到平衡的狀態才能成功地實現反向代謝工程操作。2007年，Lu C等[32]首次提出多基因啟動子改組(Multiple gene-promoter shuffling，MGPS)方法。MGPS實施的基本思路是：選擇關鍵基因不同活性范圍的啟動子，將這些啟動子與多個控制某一代謝途徑的關鍵基因進行隨機組合，并轉化受體菌，最后篩選出具有優良性狀的轉化子。PYK1、TKL1、TAL1是酵母菌糖酵解途徑與木糖代謝途徑中的3個關鍵酶基因，將它們與強啟動子HXK2和弱啟動子GND2進行不同的組合，轉化酵母，從組合文庫中篩選到了高效利用木糖的乙醇高產菌株[32]。上述HXK2、GND2均是野生型的啟動子，如若結合啟動子的定向進化，對這些啟動子進行突變，將很有可能得到性狀更優的突變株。

2.3　人工轉錄因子工程

轉錄因子是一類對基因表達調控起重要作用的反式作用因子，通常由兩部分組成：DNA結合結構域(DNA binding domain，DBD)與效應結構域(Effector domain，ED)，前者能夠特異地識別并且結合其對應的DNA序列，使該轉錄因子能夠定位到靶基因；后者通常是一個激活因子或者抑制因子，能夠激活或者抑制靶基因的表達。DNA結合結構域與效應結構域在表達調控中獨立地發揮各自的作用，人為地將不同的結構域與效應域進行組合，或是通過計算機人為設計模擬天然轉錄因子的兩種區域，即可獲得自然界中不存在的、具有新的序列特異性與作用效果的人工轉錄因子(Artificial Transcription Factor，ATF)[33]。

成功構建人工轉錄因子的核心工作是構建特異性地DNA結合結構域，鋅指結構(Zinc finger proteins，ZFPs)是真核生物中最常見的DNA結合模體，每個鋅指能識別三個堿基的DNA序列，細胞內的很多調節蛋白都含有一個或者多個鋅指結構[34]。相比于其他的DNA結合結構域，鋅指結構可以識別非回文序列，并且不受其識別序列的長度和結構的限制，僅僅對幾個關鍵位點的氨基酸加以改變就可以使鋅指結構的識別特性發生變化，因此鋅指結構成為轉錄因子模塊化設計中首選的DNA結合結構域[35]。Park等[36]對酵母的多個鋅指結構進行隨機重排，構建了人工鋅指基元文庫，成功篩選到耐熱性、耐滲性及耐藥性顯著提高的突變株。將來自酵母的鋅指蛋白文庫中三指和(或)四指的編碼基因進行突變，并使其在大腸桿菌中表達，在50℃條件下培養2 h，獲得了23個耐熱性大大提高的突變株。

在設計人工轉錄因子時，通過改變DNA結合結構域可以靈活選擇其作用靶位點，為了賦予人工轉錄因子對基因表達更好的激活、抑制或甲基化等調控功能，通常在設計的同時也要加上不同的效應結構域，包括激活結構域和抑制結構域。效應結構域的應用十分靈活方便，常用的激活結構域有單純皰疹病毒(Herps Simplex Virus)的VP1和來自NF-кB的p65亞基。Beerli等[37]利用六鋅指蛋白與4個VP16激活域構建的新的人工轉錄因子激活乳癌細胞系中原癌基因erbB-2與erbB-3的表達。常用的抑制結構域有轉錄因子SID(Sin3a interaction domain)結構域和KOX1 的KRAB(Kruppe1-associated box)結構域。Bartsevich等[38]將兩個KRAB-A的抑制域與五個鋅指結構域進行組合，構建的人工轉錄因子能很好地抑制K562細胞中多耐藥基因(MDR1)的表達。

人工轉錄因子已成為人工干預內源性基因表達的有力工具，經濟高效、應用靈活，在藥物設計、基因治療等研究領域起著重要作用。當前研究者正致力于構建更加精細的特異人工轉錄因子，只有在細胞受到刺激，相應的信號轉導通路啟動后，人工轉錄因子才被激活，進而發揮相應作用。隨著技術的進一步發展，人工轉錄因子的在各個領域定會得到更廣泛的應用。

2.4　核糖體工程

核糖體工程(Ribosome engineering)是由日本科學家Kozo Ochi率先提出的一種推理育種新方法，運用核糖體工程育種手段可以對微生物進行改造并向其引入復雜表型[39]。

作為蛋白質的合成機器，核糖體結構(包括核糖體蛋白和rRNA)和功能的改變，直接影響蛋白質的合成能力，在微生物的次級代謝產物的調控方面發揮著關鍵性的作用。四磷酸鳥苷酸(ppGpp)是誘導微生物“嚴謹反應”的信號分子，在微生物次級代謝產物的合成中起著重要的作用，當微生物的生長進入到穩定期時，由于營養物質的匱乏，細胞中核糖體的氨酰-tRNA的結合部位會與游離的tRNA結合，從而終止蛋白合成。此時細胞會通過自身的應激通路，將蛋白合成終止的信息傳遞到ppGpp的合成基因relA，ppGpp開始合成，進而激活各種次級代謝產物的生物合成。很多抗生素主要是通過與核糖體的某些部分相結合來抑制蛋白質的合成，進而起到類似于嚴謹反應同樣的作用效果[40]。因此通常微生物對抗生素抗性的變化是某些核糖體突變的直接反映，利用各類抗性突變為篩選標記，可以獲得核糖體功能突變的菌株，從而間接篩選到有利于次生代謝產物積累的突變株。常用于抗性篩選的抗生素主要包括鏈霉素(Str)、慶大霉素(Gen)、利福平(Rif)、硫鏈絲菌素(Tsp)、巴龍霉素(Par)、林肯霉素(Lin)和遺傳霉素(Gnt)等。

核糖體工程操作簡單易行，在提高次級代謝產物產量及激發潛在沉默基因表達方面最具理論基礎，其在選育抗生素高產菌株方面的應用最多。例如，核糖體蛋白SI2賦予了鏈霉菌對鏈霉素的抗性，Ochi等[41]對編碼核糖體SI2蛋白的rpsL進行突變，獲得了能夠大量積累放線紫紅素的突變株。16S RNA甲基轉移酶由rsmG基因編碼，Nishimura等[42]向rsmG引入突變，獲得大量抗鏈霉素的天藍色鏈霉球菌突變株。研究還發現，抗性選育的高產性狀具有疊加性。Nishimura等[42]利用rpsL和rsmG的組合突變，得到突變株的抗生素產量顯著提高。

3總結及展望

傳統的反向代謝工程技術因為其育種周期長、工作量大、步驟繁瑣且操作存在一定的安全隱患，其應用受到了很大的限制。而近年來，新興發展的全局轉錄機器工程、人工轉錄因子工程、核糖體工程等以它們自身的獨特優勢而逐漸受到研究者的青睞。除了上述這些正快速發展或發展成熟的方法外，最近發展起來的基因組多重自動修復技術(Multiplex automated genome engineering，MAGE)及多重染色體重組技術(Trackable multiplex recombineering，TRMR)的研發也可以為獲得理想的突變文庫提供可借鑒的方法。在實際的育種過程中，上述方法并不是單獨應用的，同時結合多種方法往往能夠取得更優的結果。

系統生物學是在組學技術的基礎上發展起來的代謝工程研究方法。利用組學技術，我們可以在系統水平上對反向代謝工程中獲得的正向突變菌株進行代謝通量分析和轉錄組學分析，更加精確地評估細胞表型。隨后根據分析結果，利用現代生物信息學技術，對細胞進行進一步的設計、修飾和合理改造，使人們快速的獲得更優良的微生物生產菌株。

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2014年福建省新批辦臺資農業項目35個

2014年1-12月福建省新批辦臺資農業項目35個，合同利用臺資1.1億美元。

據介紹，福建省累計批辦臺資農業項目2509個，合同利用臺資34.8億美元，實際到資19.6億美元，農業利用臺資的數量和規模繼續位居大陸第一。

2014年閩臺農產品貿易突破15億美元，同比增長18%以上，呈持續增長態勢。其中，廈門口岸繼續保持進口臺灣水果的第一大進境口岸，成為臺灣水果銷往大陸各地的重要中轉站。

此外，福建省10個閩臺農業合作推廣示范縣2014年引進臺灣果樹、食用菌、蔬菜、中藥材等新品種45種，引進新技術28項，建立良種及技術示范基地4000多hm2，推廣帶動8萬多hm2。

[摘自：福建農業信息網.(2015-02-03). http://www.fjagri.gov.cn/html/mthz/mtdt/2015/02/03/140262.html.]

Advances on Inverse Metabolic Engineering

ZHOU Xiao-fei1, CHEN Ting-ting1, TIAN Ye1, HUANG Min1, SHI Bi-hong1,2

(1.CollegeofLifeScience,FujianNormalUniversity,Fuzhou,Fujian350108,China;

2.EngineeringRescherCenterofIndustrialMicrobiology,MinistryofEducation,FujianNormal

University,Fuzhou,Fujian350108,China)

Abstract:Inverse metabolic engineering is a kind of new genetic engineering, which can get complex phenotypes regulated by multiple genes by constructing a library of cells with genetic diversity, following with efficient high through-put screen. Currently, it has become a powerful tool for researching biological metabolic pathways and modifying the biological properties of strains in industrial biotechnology. One of the bottleneck problems in inverse metabolic engineering is how to obtain a variety of cell phenotype mutant library. This paper briefly introduced several classic and recently developed ways to solve the bottleneck problem, and listed the latest research progresses of these methods.

Key words:inverse metabolic engineering; mutant library; cell phenotype; high through-put screen

文獻標志碼：A

文章編號：1637-5617(2015)01-0073-06

中圖分類號：Q78

doi:10.16006/j.cnki.twnt.2015.01.016

基金項目：福建省科技重點項目(2009N0033)

通訊作者：施碧紅(1968-)，女，博士，教授，研究方向：微生物分子生物學. E-mail：shibh@fjnu.edu.cn

作者簡介：周筱飛(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：微生物遺傳育種. E-mail：773737480@qq.com

收稿日期：2014-12-13