中藥作用靶點的預測及發現方法研究進展

朱海林，王振洲，高爽，李平亞，劉金平※

(1．吉林大學再生醫學科學研究所，長春 130021； 2．中國藥科大學，南京 210009)

中醫藥在中國已經發展幾千年，并且形成了自己的獨特理論。在臨床治療上具有毒副作用小、作用持久以及耐受性差等特征[1]。近年來，由于多靶點藥物研發的興起以及網絡藥理學、各種組學等新的分析研究手段的出現，世界各國對中藥關注度和認可度明顯上升[2]。但是，由于中藥在分子水平上對人體作用機制的研究還不夠清晰，從而阻礙了中醫藥的現代化以及走出國門[3]。如何在探索機制的同時又突顯出中醫藥理論的精髓成為亟待解決的問題。不同于“單成分-單靶點”的作用過程，中藥的多組分作用于多個靶點，研究時需要注重靶點或成分之間的關聯。確證中藥作用的靶點，對闡明我國傳統藥物的作用機制具有重要的理論價值，也為中藥的臨床應用提供重要參考。近年來，隨著生物信息學和計算機科學的發展，涌現了多種靶點預測、識別和確證的方法。網絡藥理學可對大量的靶點進行初步篩選，將中藥可能作用的靶點做一個排序；計算機輔助藥物設計在合理藥物設計的同時對闡述中藥多靶點的機制也有重要意義；由于90%的已知藥物靶點為蛋白質，為蛋白質組學在實驗水平上驗證潛在的作用靶點提供了客觀上的可能性。此外，多種技術手段聯用也可進一步提高多靶點預測的準確性。

1 基于計算方法的中藥靶點的預測和識別途徑

1.1 網絡藥理學

網絡藥理學[4](Network pharmacology)通過將活性成分、作用靶點和疾病的關系在計算機上以數學計算模型的方式表現出來。運用網絡藥理學研究中藥的模式主要是從已有的相關文獻和數據庫獲取大量相關的靶點和化合物信息，經過口服生物利用度、五倍律等一系列預篩選，建立藥物-靶點-疾病的相關模型，預測結果由文獻佐證或實驗進一步驗證。吳磊宏等[5]將附子中22個化學成分與DrugBank中的已知靶點構建預測集，對網絡模型分析后發現，共涉及75個靶點，單個靶點與平均4.77個化合物相關，每個成藥性良好的成分平均與16.3個靶點作用。附子預測的潛在作用靶點均得到了文獻的證實，證明此方法可用于發現中藥的某些潛在作用靶點。

作為新興的交叉學科，網絡藥理學不僅能夠揭示單味中藥的作用機制，還能將古老的中藥方劑和現代科學連接，揭示中藥成方的作用機制[6，7]。李翔等[8]在復方丹參方中選取9個具有活性的化合物，與相關的疾病和基因在Cytoscape中構建3者相互聯系的網絡模型。結果顯示，復方丹參方中的9個活性成分可調控與30多種心血管疾病相關的42種基因的表達。Tao等[9]以郁金散為例研究心腦血管疾病的發病機制，經過口服生物利用度、類藥性模型篩選候選活性成分，結果，從郁金散中找出了58個具有生物活性的化學成分，通過建立靶點-疾病網絡，預測了32個與心腦血管疾病相關的靶點。

臨證加減理論(AST)是傳統中醫藥中的基本用藥理論，Li等[10]將大柴胡湯和小柴胡湯中所有中藥的已知化學成分從TCMSP數據庫下載下來，經過口服利用度及藥物半衰期初步預測，篩選的化學成分基于random forst(RF)和support vector machine(SVM)方式分別建立藥物-靶點網絡和靶點-疾病網絡。結果表明，在64個候選化合物中有23個化合物與超過14個靶蛋白同時作用。并且，有部分靶蛋白和多種候選藥物同時作用，如PGHS-1這種與肺癌相關的靶蛋白和多個藥物成分高度相關。

綜上所述，網絡藥理學的應用主要有：從中藥中發現活性良好的小分子候選化合物，為藥物的合理設計提供先導化合物；將其與中醫藥理論契合在一起，有助于揭示君臣佐使、四氣五味等中藥理論；借助于網絡藥理學強大的儲存生物學數據功能，使其以一個系統的視角分析如AD等復雜疾病的發病機制。

1.2 計算機輔助藥物設計

計算機輔助藥物設計[11](computer aided drug design，CADD)方法是以計算機為工具，應用配體-受體相互作用原理，采用各種理論計算方法和分子構象模擬技術，根據積累的大量活性化合物構效關系研究成果，設計出具有某一藥效的先導化合物。虛擬篩選與藥效團設計是CADD中應用廣泛的2種方法。虛擬篩選主要是以分子對接、反向分子對接等為代表，廣義地說，任何一種基于某種提問形式，從現有的小分子數據庫中搜尋符合條件的化合物都可稱為虛擬篩選。目前有眾多運用于CADD的服務器，例如PLANTS、GOLD、DOCK Blaster、LEA3D、3DLigandsite、PharmMapper等。

分子對接用于探究中藥的潛在靶點和作用機制以及研究中藥成方的藥理作用機制[12，13]。Chang等[14]通過對天然藥物進行分子對接的虛擬篩選，以期從中得到新的抗炎因子。20 000多種中藥活性成分與mPGES-1進行對接，得到奎尼酸等有良好抗炎作用的天然活性成分。羅麗萍[15]在MVD(Molecular Virtual Docker 5.5)中將12種花青素類活性分子和以HER-2酪氨酸激酶區為受體模板創建的位點進行分子水平的對接試驗。結果顯示，12種活性成分均作用于HER-2激酶區中ATP與HER-2作用的活性腔，預測花青素是以競爭性結合方式發揮抗癌作用的。潘婷婷等[16]選擇30個中藥有效成分與PAR-1受體通過Schr?dinger軟件中的Glide模塊進行分子對接，尋找可能的拮抗劑。結果顯示，虛擬篩選出的活性成分隱丹參酮等具有確切的拮抗作用，并且已經得到相關的分子生物學實驗的驗證。劉美鳳[17]使用Discovery Studio 2.1中的CDOCKER模塊，將番石榴葉中32個小分子與糖尿病有關的4個生物活性酶分子對接后發現，番石榴葉的黃酮類和鞣質化合物與PTP1B和PPARγ結合緊密。并且預測可以通過引入疏水基團加強其降糖的功效。反向分子對接[18]是以小分子化合物為探針，在已知的靶點數據庫內搜索可能與其結合的受體蛋白，直接發現活性成分的靶點。這種實驗方法思路清晰、簡單。陳少軍[19]使用PharmMapper服務器對茯苓酸和丹參醇A進行反向分子對接，計算得出相關的配體分子。驗證表明，Trasthyretin、Vitamin D3 receptor、Corticosteriod 11 beta dehydrogenase isozyme 1為茯苓酸的靶點，醛糖還原酶可能是丹參醇A的靶蛋白之一。

藥效基團模型法是一種通過分析一組中藥活性分子的藥效構象，找出共同的特征結構，建立藥效基團模型，以此檢索三維結構數據庫，發現符合藥效基團要求的化合物，與中藥成分結構比對，評價中藥各成分的生物活性和成藥性。常見的軟件系統有Unity-2、Catalyst和Apex-3D。王星等[20]采用該方法研究辛味藥性與TRPV1之間的關系。結果證明，由16個已知的TRPV1激動劑構建的藥效團模型不但命中包括辣椒素、吳茱萸堿、桂皮醛等來源于辛味中藥的活性成分，而且揭示了TRPV家族與辛味藥性之間的相關關系。

計算機輔助藥物設計將古老的中藥和當今科學銜接起來，在發現和驗證中藥活性成分的潛在靶標起著重要作用，同時，可以減少藥物靶點設計的時間和金錢成本，對中藥復方的作用機制研究提供了新的思路和依據。

2 基于實驗方法的中藥靶點識別和確證途徑

2.1 蛋白質組學

蛋白質組學(Proteomics)是一門以生物體內所有蛋白質的存在、表達、相互作用等活動方式為研究對象的學科。對于中藥多靶點的研究，應用蛋白質組學對不同靶蛋白識別或從眾多蛋白中分辨出靶蛋白是一個高效的途徑[21]。

張麗軍[22]依據蛋白質組學的高通量、高靈敏度等特點將其運用于探究唐草片抗病毒的作用機制。研究采用SDS-PAGE分離微粒體蛋白質、切取CYP450酶對應分子量的條帶、通過液相色譜串聯質譜進行鑒定，采用多反應監測(MRM)方法對鑒定的CYP2C11進行定量分析。結果證實了唐草片對CYP450代謝酶和CYP2C11的表達變化。姚辛敏[23]利用差異蛋白質組學研究地黃飲子對AD細胞模型的影響，進一步闡明地黃飲子治療AD的機制；研究比較了模型組和地黃飲子組對AD細胞模型的作用，結果發現，模型組和給藥組均能上調相關蛋白質的表達，推測地黃飲子在治療AD發病初期機理可能是調節細胞中有關的蛋白質點起動，從而保護受損細胞。戎志斌[24]使用蛋白芯片質譜儀對柴胡疏肝散組、對照安理申組、空白組的含藥血清進行蛋白質組學分析，觀察飛行時間質譜狀圖發現，二者對機體的藥理作用存在顯著差異。Sun等[25]使用二維凝膠電泳和基質輔助激光解析串聯飛行時間質譜儀尋找銀柴胡湯治療肝損傷的靶蛋白，結果發現，15個蛋白位點在治療前后發生了改變，其中鋅指蛋白407、凝血酶原、結合珠蛋白等7個蛋白顯著下調。Zohreh Firouzi等[26]在對姜黃中的姜黃素進行生物活性和副作用評價時，先采用親和色譜法純化出與其作用的相關蛋白質，在此基礎上使用二維凝膠電泳和質譜進一步遴選和鑒別作用蛋白質。結果顯示，姜黃素能夠和細胞內一系列的結構蛋白、代謝酶和參與體內細胞凋亡的蛋白質結合而發揮藥理作用。

一般蛋白質組學在中藥靶點方面的研究主要流程為：樣品(來源于培養的細胞、人或動物)在與中藥(單個化合物或復方)結合后運用二維凝膠電泳和染色技術，比較表達有差異的蛋白質，將差異蛋白進行消化和質譜分析，最后經一系列生物信息學和體內或體外的藥效學研究推斷出作用靶點和生物通路[27，28]。研究的基本策略也是蛋白質組之間的比較，即給藥前、后的樣本組織、細胞或體液的蛋白質表達量的上調或下降。

2.2 生物芯片技術

生物芯片技術[29](Biochip)是在微加工以及微電子兩項技術基礎上，通過建立的固體基質表面微型生化分析系統，從而對生命體內的生物組分(蛋白質、核酸等)進行快速檢測。生物芯片包括蛋白質芯片與基因芯片，二者原理相類似，都是在分子間特異地相互作用基礎上發展而來。

李英博等[30]利用MTT比色法確定了人參皂苷Rg1促進人神經干細胞增殖的最佳濃度后，采用基因芯片雜交技術，獲取了基因表達的信號強弱，運用相關的圖像和數據分析軟件進行分析。結果顯示，促進人神經干細胞增殖差異基因中顯著上調的266個，下調的174個，這些基因和CAMP-PKA以及PL3K-AKT信號傳導通路有密切關系。蛋白質芯片技術是在基因芯片的基礎上發展而來的，了解一個基因的功能，必須最終在蛋白質水平上確認。玄毅等[31]運用SELDI蛋白質芯片技術，對注射了魚腥草的實驗動物中血清蛋白進行蛋白組檢測。結果發現，魚腥草注射液對3511Da、3522Da、7981Da、3960Da、3975Da等蛋白有調節作用。

生物芯片技術具有分析靈敏、重現性好、自動化等特點[32]，在新藥靶點的篩選方面具有廣闊應用前景。

3 基于聯用技術的中藥靶點確證途徑

中藥作用的機制強調的是整體性、協同性，網絡藥理學是在系統生物學、系統藥理學基礎上發展起來的。網絡藥理學作為一種技術手段能夠有力地推動中藥現代化的發展，它的出現同時增加了當前新藥研發的方法[32]。但是網絡藥理學主要是從理論上驗證或預測組合藥物靶點[33～35]。越來越多的科研工作者采用聯用的方法，為網絡藥理學結果現實證據。例如，利用組學技術或高通量技術，觀察藥物對模型(細胞或動物)的作用或模型對藥物的作用，針對所產生的大量數據，在生物信息學的基礎上建立藥物、靶點和疾病三者的網絡，進一步闡明藥物可能的作用機理。劉慶山[36]采用網絡藥理學合理選擇相關靶點，然后建立高通量篩選的方法對復方白脈散全組分進行篩選和活性評價，取得理想的效果，并且預測高內涵篩選方法對網絡藥理學的發展和應用將起到推動作用。

Ⅱ型糖尿病是一種慢性病，發病原因復雜，中藥中的多種成分可以同時作用多個靶標，從而達到治療的效果。Gu等[37]利用軟件Cerius2的定量構效關系模型對糖敏靈中676個化合物進行整體性描述，通過LigandFit將其與37個相關的糖尿病靶蛋白進行分子對接，將分數排在前3%的分子和靶蛋白構建了藥物-靶點網絡，與共有靶標超過一個的小分子構建藥物-藥物網絡，結果揭示了糖敏靈中的活性成分，有些并且已經得到文獻證實。Chen等[38]在研究扶正抑瘤湯的抗癌機制時首先采用指紋圖譜技術進行分析得出21個主要的扶正抑瘤湯成分，將其分別與Bcl-xl、IL-2、TNF-α等進行分子對接，評價它們的抗癌活性。結果發現，活性成分對3個因子的釋放均有不同程度的抑制作用。丁俊杰[39]對ω-芋螺毒素進行定量構效關系(QSAR)研究，建立相關的虛擬組合多肽庫，分別采用QSAR模型預測和相似性搜索2種方法對多肽庫進行篩選。結果得出6個N-型和19個P/Q-型鈣離子通道拮抗劑。多種虛擬篩選的方法同時使用，提高了擊中靶點的概率。

4 小結與展望

如上，常見的用于尋找中藥靶點的技術都是建立在強大的信息支持上，在應用過程中都使用了較多的數據庫。如何在追求數據總量的基礎上使科研工作者獲取數據的有序性影響著數據轉化為科研成果的概率，并且處理數據的服務器朝著更易操作的方向發展。中藥靶點的預測和確證方法大多是多學科融合的，比如網絡藥理學是由系統生物學、生物信息學、計算機信息學等多學科共同組成的交叉學科[40]，只有借助于多種工具共同發展，逐漸從一個成分、一個靶點的思路向多成分、多靶點轉變，注重成分之間的協同作用、靶點之間的聯系，才能使中藥走得更遠。

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