多種探針的RT-PCR檢測H5N1病原體方法的建立及應用

孫春瓊　沭陽南關醫院檢驗科，江蘇省沭陽縣　223600

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多種探針的RT-PCR檢測H5N1病原體方法的建立及應用

孫春瓊沭陽南關醫院檢驗科，江蘇省沭陽縣223600

摘要目的：探究多種探針的RT-PCR檢測H5N1病原體方法的建立及應用。方法：分析Genbank數據庫的基因序列，針對保守區分別設計并合成兩對特異性引物(P1/P2，P3/P4)。通過對擴增條件的優化，建立了檢測兩種病毒的快速雙重PCR方法。結果：合適引物濃度為P1/P2為0.32μmol/L，P3/P4為0.96μmol/L。雙重檢測的最小病毒核酸量為2ng/μl，H5N1病原體混合液在相對應位置出現特異性條帶，而其他病毒及空白對照均未出現條帶。結論：多種探針的RT-PCR檢測H5N1病原體具有敏感性高、特異性強等優點，對于禽流感的預防和控制具有積極的作用。

關鍵詞逆轉錄聚合酶鏈式反應H5N1病原體探針引物

禽流感由于其高致病性曾經給養禽業帶來致命的打擊，有些禽流感甚至可以直接傳染給人。近年來禽流感又反復出現，引起了相關部門的廣泛關注，也成為了當前研究的熱點。其中，H5N1傳染性強，為衛生部新傳染病防治法中規定報告的法定傳染病，可以通過人畜傳播，具有較強的致病性。目前，國際上比較常用的檢測禽流感病毒的方法為雞胚病毒分離法，但是由于檢測過程比較繁瑣，耗費較長的時間和精力，不適合用于大型的傳染病檢測[1]。近年來，隨著分子生物技術的不斷發展，為檢驗及診斷學帶來了很多便利。其中RT-PCR檢測由于其定量準確、特異性強、敏感度高等優點，為H5N1病原體的檢測帶來了很多便利。本文主要闡述了多種探針的RT-PCR檢測H5N1病原體方法的建立及應用，具體報道如下。

1材料與方法

1.1實驗樣本收集2014年1月H5N1禽流感暴發流行期間的H5N1病毒株，在實驗室內進行分離，提取H5N1亞型標準抗原并進行保存。

1.2試劑和儀器QIAamp病毒RNA提取試劑盒購自德國QIAGEN公司，SARS-CoY RNA熒光定量聚合酶鏈反應法試劑盒、禽流感病毒H5亞型熒光RT-PCR檢測試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，鼠源逆轉錄酶、Taq酶、RNA酶抑制劑、dNTP購自Promega公司。分子生物學軟件選擇DNAstar 10.0版本，primer 10.0版本。儀器選擇PE 9600PCR儀、uglltcycler熒光PcR檢測儀。

1.3實驗方法

1.3.1RNA的抽提：采取標本，立即進行前處理，使用QIAamp病毒RNA提取試劑盒(產自德國QIAGEN公司)抽提禽流感病毒RNA。嚴格按照試劑盒說明書進行操作，以H5N1病原體RNA為模板，P1/P2為引物進行RT-PCR，反應結束后用15g/dl的瓊脂糖凝膠電泳鑒定RT-PCR產物。反應條件為:42℃40min，94℃4min，然后94℃35s，42℃35s，72℃35s，35個循環，最后72℃延伸8min[2]。

1.3.2引物設計：參照GenBank數據庫中已注冊的禽流感病毒H5N1亞型毒株的基因核苷酸序列，用primer10.0版本軟件設計多對引物P1/P2和P3/P4，同源性分析采用DNAstar10.0版本生物軟件進行比較，理論跨幅為290bp和320bp[3]，引物及探針序列如下(由上海生工生物工程有限公司提供)。引物序列(5’端用生物素標記)：上游：5’-TATTCAACAGTGGCGAGTTCCCTAG-3’(25bp)；下游：5’-GCAAATTCTGCATTGTAACGATCC-3’(24bp)；探針序列為：5’-GCTGGTCTATCTTTATGGATGTGCT-3’。

1.3.3PCR檢測：選取最佳引物濃度，以上述反轉錄產物為模板，進行PCR敏感性實驗，具體操作如下：94℃3min，然后進入循環94℃30s，54℃30s，72℃30s，30個循環，于72℃延伸10min，4℃保存。用10g/dl瓊脂糖凝膠電泳檢測，取5μl PCR產物與6×Loading buffer 1μl混勻，點樣，100～120V電泳30min，在紫外燈下觀察擴增片段判斷結果[4]。

2結果

2.1確定引物濃度本次共實施5組實驗，P1/P2的引物濃度分別為0.32、0.48、0.64、0.80、0.96μmol/L。P3/P4引物濃度分別為0.32、0.48、0.64、0.80、0.96μmol/L。經過檢測實驗，合適的引物濃度為P1/P2 0.32μmol/L，P3/P4 0.96μmol/L。進行PCR反應體系擴增，測序結果與GenBank數據庫中已注冊的兩種禽流感病毒的基因核苷酸序列進行比較，同源性達98%以上。

2.2特異性與敏感性檢測經測定10-4病毒液的RNA濃度為2ng/μl，因此該方法可檢測的最小病毒核酸量為2ng/μl。根據雙重PCR分析，H5N1病原體混合液均在相應位置出現兩條特異性條帶，其他病毒及空白對照均未出現條帶，特異性明顯。P1/P2和P3/P4二聯檢測10倍梯度稀釋的單項模板，P1/P2和P3/P4的敏感度都為10-4，與單項RT-PCR敏感性相同。

3討論

禽流感是一種烈性傳染病，是當今世界人類面臨的最嚴重的健康威脅之一，它能引起動物及人類傳染急性呼吸系統疾病，被國際獸疫局確定為Ⅰ類烈性傳染病，世界衛生專家曾多次強調加強禽流感病毒的防控及研究對于動物和人類健康具有重要的意義。由于禽流感病毒血清型較多，且容易發生變異，因此尋找一種快速、準確的檢測禽流感病毒，尤其是具有高致病性的H5N1亞型病毒的方法至關重要。

禽流感病毒的檢測一般需要依靠實驗室檢查，其中病毒的分離鑒定是最終確診的主要依據，實驗室檢查雖然準確度較高，但耗時較長、操作繁瑣，需要專業人員才能完成，不適合用于大規模的臨床檢測，此外，血清學檢測也是臨床上一種常用的診斷技術，但是其特異性及敏感性有限，用于檢測H5N1病毒具有一定的局限性。近年來分子生物學技術發展迅速，已被大量用于禽流感病毒的檢測，其中主要的檢測方法有聚合酶鏈反應、反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和熒光RT-PCR、核酸分子雜交、基因探針技術、ELISA等方法。RT-PCR是近年來發展的一種較為成熟的體外基因擴增技術，具有準確、快速、簡單的優點，已經成功的用于多種病毒的基因檢測。

目前關于H5N1亞型病毒的研究越來越多，Chen等對來自我國南方地區的21株宿主為鴨的H5N1禽流感病毒進行了分離和全基因組測序，并與Genbank中的某些病毒株一起構建了系統發育樹，用于相關基因的進化研究[5]。本文結果顯示，合適的引物濃度為P1/P2 0.32μmol/L，P3/P4 0.96μmol/L，PCR反應體系擴增后基因測序結果與GenBank數據庫中已知的基因核苷酸序列進行比較，同源性達98%以上。P1/P2和P3/P4二聯檢測10倍梯度稀釋的單項模板，P1/P2和P3/P4的敏感度都為10-4，與單項RT-PCR敏感性相同。就檢測敏感性與特異性而言，在理想狀態下，只要退火溫度足夠低，能夠保證引物同目的序列有效退火，就可以減少檢測過程中的非特異性結合，提高檢測的特異性，而根據雙重PCR的分析結果恰恰證明了這一點，H5N1病原體混合液均在相應位置出現兩條特異性條帶，而其他病毒及空白對照均未出現條帶。就敏感性而言，在多種探針的應用中，多重PCR引物檢測的敏感性幾乎接近單重PCR水平，敏感性較高。此外，多重PCR引物可以用于成組病原體的檢測，但是引物濃度是關鍵，只要選擇合適的引物濃度，多個PCR中不同的引物就可以在同一反應體系中進行特異性擴增，在同一個PCR反應中就可以同時檢測多種病原體，節省時間，提高檢測效率。

目前，RT-PCR技術已經成功應用于醫學研究、流行病分子生物學等多個領域，也為臨床診斷提供了新的思路。

RT-PCR技術具有針對性強、檢測周期短、特異性高等優點，可以有效的檢測出H5N1病毒，對于禽流感的預防和控制具有積極的作用，值得在臨床進一步推廣應用。

參考文獻

[1]彭宜，謝芝勛，等．H9亞型禽流感病毒RT-LAMP可視化檢測方法的建立〔J〕.中國人畜共患病學報，2011,27(1)：19，22．

[2]孫陽,沈銀忠.新型禽流感：H7N9〔J〕.檢驗醫學,2013,28(9):739.

[3]Jiang T，Kang XP，Deng YQ，etal．Development of areal time RT-PCR assay for anovel influenza A(H1N1)virus〔J〕.Journal of virological Methods,2010，163(2):470-473.

[4]婁國平,李顯東,等.多種探針的RT-PCR檢測H5N1病原體方法的建立及應用〔J〕.現代檢驗醫學雜志,2014，29(5):73-75.

[5]鐘靜,黃平,等.廣東兩株人禽流感H5N1毒株節段基因及蛋白特征和進化分析〔J〕. 中華傳染病雜志，2011,29(3):171.

(編輯雅文)

收稿日期2015-02-12

中圖分類號：R446.5

文獻標識碼：B

文章編號：1001-7585(2015)18-2527-03