基質金屬蛋白酶1與肝纖維化的研究進展

杜　超(綜述)，程雙平(審校)

(成都軍區總醫院消化內科，成都 610083)

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基質金屬蛋白酶1與肝纖維化的研究進展

杜超(綜述)，程雙平※(審校)

(成都軍區總醫院消化內科，成都 610083)

摘要：肝纖維化是各種原因所致肝損傷的共同病理變化，是慢性肝病逐漸演變發展為肝硬化過程中的必經途徑。肝纖維化時細胞外基質(ECM)合成增加，其中以I型膠原為主；積極降解和消除過多的ECM，有望逆轉肝纖維化進程。而基質金屬蛋白酶1(MMP-1)作為人類主要降解I型膠原的膠原酶，為肝纖維化治療帶來了廣闊的前景。該文就MMP-1與肝纖維的關系予以系統闡述，以期為肝纖維化的治療提供新的思路。

關鍵詞：肝纖維化；細胞外基質；肝星狀細胞；基質金屬蛋白酶1；基質金屬蛋白酶抑制劑

在體內外有害因素的持續刺激下(包括病毒性肝炎、酒精濫用、藥物、代謝性疾病、鐵或銅的過載、自身免疫性疾病等)，肝臟最終會走向肝纖維化甚至肝硬化的道路[1-2]。肝硬化是肝纖維化的終末期，其特點是細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的大量沉積和再生結節的形成[3-4]，同時伴有肝衰竭和門靜脈高壓癥[5]。肝纖維化在臨床不易早期發現診斷，大多數患者直到晚期或肝硬化的階段才被發現，給治療帶來了一定的限制；而晚期肝纖維化由于ECM的大量沉積和肝實質細胞的大量壞死崩潰，要達到完全逆轉幾乎不可能。肝移植是目前治療晚期肝硬化最為有效的方法[6-7]。現就基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)1與肝纖維化的關系予以綜述。

1肝纖維化發生機制

肝纖維化是ECM成分改變和數量增加的結果，是包括纖維膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、透明質酸和蛋白多糖在內的ECM合成增加及降解減少的結果[8]。在損傷肝臟中，肝星狀細胞是主要的ECM產生細胞，同時肝門部的成纖維細胞也發揮重要作用[9-10]。在正常肝臟中，肝星狀細胞位于Disse間隙，是維生素A主要的存儲細胞，當肝星狀細胞激活后分化為肌纖維母樣細胞，分泌收縮蛋白和大量ECM，尤其是Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維[11-12]。研究發現，非實質細胞的激活，如庫普弗細胞，在肝星狀細胞的活化機制中發揮重要作用[13-14]。MMPs降解ECM的活性下降，主要是由于其特異性抑制劑MMPs抑制劑(tissue inhibitor of MMPs，TIMPs)的表達增加所致。人類膠原纖維降解的關鍵酶是MMP-1，而在嚙齒目動物中是MMP-13[15-16]。然而,在肝纖維化形成過程中，MMP-1和MMP-13的表達非常有限，而MMP-2的表達增加[17-18]；相反，包括TIMP-1和TIMP-2在內的TIMPs高表達[19-20]。因此，MMPs的低表達和TIMPs的高表達是肝纖維化形成的重要原因。

2MMP-1概述

MMPs是一類結構高度同源的分泌型或膜相關性鋅內肽酶的總稱，因其發揮生物學活性需要鈣離子、鋅離子等金屬離子輔助而得名，主要生物學功能是降解ECM成分；目前已發現28種MMPs，分別編號為MMP-1～28；根據其作用底物和結構特征可分為6大類，其中MMP-1屬于膠原酶類，也被稱為間質膠原酶和成纖維細胞膠原酶，主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型膠原和蛋白多糖，可由成纖維細胞、巨噬細胞、內皮細胞、中性粒細胞等分泌，是一種最早從脊椎動物中克隆出互補DNA基因并純化為蛋白的膠原酶[21]。在正常體內MMP-1水平極低，一般難以檢測，但在各種刺激下可高表達，發揮其生物學功能[22]。人MMP-1基因定位于染色體11q22.3上，屬于MMPs家族基因的一部分，其他MMPs家族基因包括MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-10、MMP-12、MMP-13、MMP-20、MMP-27 共8種基因[23]。MMPs家族都具有相似的結構特點，而MMP-1同樣具有以下結構：疏水信號肽序列、前肽區、催化活性區和C端區，疏水信號肽區引導細胞質合成的多肽轉移到內質網,在其成熟后部分被降解；前肽區主要作用是保持酶原穩定，通過阻斷酶的鋅離子活性中心與底物的結合,使酶原免于激活，而當該區域被外來酶切斷后則可使酶原激活；催化活性區由5對高度扭曲的β-折疊、3個α-螺旋和1個8字環組成，封閉了5個金屬離子位點，包括3個鈣離子和2 個鋅離子位點；其中1個鋅離子具催化活性,通過3個 His殘基束縛在序列 HELGHXXGXX中,是酶活性所必需的輔助因子;另1個鋅離子為結構性位點；C端區含有200多個殘基,包含4個決定底物特異性的重復Cys殘基序列[24]。MMP-1在正常組織體內水平極低，而當受到外來刺激如創傷、修復或者重構等病理情況，則表達量相應增多。MMP-1的活性在體內外受到3個水平的調節，即基因轉錄水平、酶原活化調節以及活化后特異性調節。

3MMP-1與肝纖維化

如上所述，逆轉MMPs 活性太低和TIMPs過表達之間的不平衡，則可能促進ECM降解從而逆轉肝纖維化。在理論上有兩種方法可以扭轉這種不平衡，上調纖維化肝組織中膠原酶活性。一種方法是MMPs在肝臟的過表達，另一種是抑制TIMPs活性。MMPs家族可以消化膠原纖維，而在人類消化能力最強的是MMP-1[25]。有人使用腺病毒載體將編碼人類MMP-1的DNA傳遞到硫代乙酰胺誘導的肝纖維化大鼠模型中，觀察到膠原纖維降解增加，大鼠肝纖維化程度減輕；其可能機制是由于MMP-1的過表達導致纖維膠原的降解，影響ECM和肝細胞之間的相互作用，直接刺激肝細胞增殖[26]。此外，MMP-1的過表達還可使ECM結合的多種生長因子釋放出來(如肝細胞生長因子)，釋放的生長因子反過來可促進肝細胞增殖[27]。因此，MMP-1的基因傳遞為晚期肝纖維化或肝硬化的治療帶來新的希望。使用類似的方法，將人中性粒細胞膠原酶MMP-8通過基因傳遞的方法來治療肝纖維化已取得良好效果；在該實驗中，腺病毒載體轉移MMP-8基因到四氯化碳或膽管結扎誘導的肝纖維化大鼠模型中，觀察到肝纖維化程度減輕，伴隨著腹水的改善和胃底曲張靜脈程度的減輕[28]。

4MMP基因傳遞方法

4.1病毒載體病毒載體來自于病毒的RNA或DNA 基因組，可作為定向或非定向載體，其中來自于RNA病毒的反轉錄病毒載體，可分為癌基因反轉錄病毒、慢病毒、泡沫病毒；來源于DNA的病毒載體中，應用較廣的是腺病毒和腺相關病毒；任何類型的病毒載體都有各自的優缺點，反轉錄病毒載體能夠長時間穩定轉染，但轉導效率較低，并且有導致基因突變的危險；腺病毒載體的優點是在體外和體內都能非常有效地轉染靶細胞，同時其免疫原性和毒性較低，在臨床有較大的應用空間[29-30]。腺相關病毒載體是一種來自于人非致病性的細小病毒，目前已被作為治療多種遺傳性疾病的載體。腺病毒載體作為MMP基因的載體來治療肝纖維化的療效已被證實[31]。然而，腺病毒載體要進一步應用于臨床仍有許多問題亟待解決，如免疫原性、毒性以及轉染細胞可能發生的誘變等。

4.2非病毒載體非病毒載體可避免病毒載體應用的一些問題，包括：裸DNA的物理傳遞方法(如電穿孔法、基因槍、超聲波等)和化學載體(如陽離子聚合物和脂質體)[32]。有報道將MMP-1的編碼質粒DNA通過陽離子化明膠凝膠作為載體，治療鏈霉素誘導的腎纖維化[33]。為了方便質粒DNA持續釋放，將可生物降解的凝膠制作為陽離子化的明膠微球，通過凝膠的逐漸降解緩慢釋放出質粒DNA。這種通過傳遞MMP質粒DNA的方法來治療晚期肝纖維化也許會成為現實。

4.3間充質干細胞(mesenchymal stem cell,MSCs)近來研究發現，MSCs可作為基因治療較為理想的靶細胞，MSCs作為靶細胞具有以下優勢：①MSCs取自骨髓，來源充足，取材容易；②MSCs具有體外培養的遺傳穩定性和可移植性；③MSCs免疫原性低；④MSCs易于外源基因表達[34]。這些優勢使MSCs在基因治療中具有較好的應用前景。MSCs的基因修飾已在骨骼疾病、心血管疾病、神經系統疾病和急慢性肝損傷的治療中顯示了一定的價值。Hasharoni等[35]將轉染重組人骨形態發生蛋白2的MSCs注入鼠脊柱旁，觀察到新骨形成，并與脊柱融合。Matsumoto等[36]將血管內皮生長因子基因轉染入骨髓MSCs后對大鼠急性心肌梗死模型進行同種異體移植治療，結果顯示，異體大鼠MSCs可在梗死的心肌組織定植、生存，并可轉化為心肌細胞及血管內皮細胞，血管內皮生長因子基因轉染組左心室射血分數顯著升高，梗死邊緣區心肌面微血管數目明顯增加。魏曉龍等[37]利用MSCs成功將MMP-1傳遞到肝纖維化大鼠體內，結果觀察到MSCs在肝臟特異性定植、分化，過表達MMP-1顯著降解肝臟膠原，修復纖維化肝臟效果明顯優于使用腺病毒載體傳遞MMP-1。因此，MSCs將成為未來MMP基因傳遞新的研究方向。

5小結

通過傳遞外源MMP基因來扭轉纖維化肝臟中MMPs活性太低和TIMPs太多之間的不平衡，從而治療肝纖維化是可行的。然而，外源MMP基因持續的過度表達，除了可降解病理沉積的ECM外，另一方面也可能消化正常的肝臟組織框架。因此，如何精確地控制MMP活性是下一步臨床應用中必須處理的關鍵問題，以期找到一個安全、高效的MMP系統來治療肝纖維化和肝硬化。

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Research Progress of Matrix Metalloproteinase-1 in Liver FibrosisDUChao，CHENGShuang-ping.(DepartmentofGastroenterology,ChengduMilitaryCommandGeneralHospital,Chengdu610083，China)

Abstract:Liver fibrosis is the pathological basis of chronic liver disease and an inevitable path to the cirrhosis.In liver fibrosis,the synthesis of extracellular matrix(ECM) increases,especially the collagen type I;therefore the active degradation and elimination of ECM is expected to reverse liver fibrosis.Matrix metalloproteinases 1(MMP-1) is a major human interstitial collagenase that can degrade type I ECM,which has brought broad expectation for the treatment of fibrosis.Here is to make a review of the relationship of MMP-1 and liver fibrosis,so as to provide new ideas for the treatment of liver fibrosis.

Key words:Liver fibrosis; Extracellular matrix; Hepatic stellate cell; Matrix metalloproteinase-1； Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase

收稿日期：2014-09-25修回日期：2014-11-23編輯：鄭雪

基金項目：四川省衛生廳基金(2010 0091); 成都軍區總醫院院管課題基金(YG110-A)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.13.007

中圖分類號：R57文獻標示碼：A

文章編號：1006-2084(2015)13-2321-03