富油微藻布朗葡萄藻分子生態學研究進展

馬麗芳, 劉俊稚, 劉新穎, 汪志平, 陳子元

浙江大學原子核農業科學研究所, 農業部核農所重點開放實驗室, 杭州 310029

富油微藻布朗葡萄藻分子生態學研究進展

馬麗芳, 劉俊稚, 劉新穎, 汪志平*, 陳子元

浙江大學原子核農業科學研究所, 農業部核農所重點開放實驗室, 杭州 310029

分子生態學是研究生命系統與環境系統相互作用機理及其分子機制的科學，可以從宏觀和微觀結合的角度真實反映生態現象的本質。簡述產烴布朗葡萄藻形態與化學種等生理生態特征的基礎上，綜述了近年來國內外布朗葡萄藻分子生態學研究的新進展，主要包括分子系統發育學及其與化學種、基因組、地理來源等之間的關系。經典分類學上，關于布朗葡萄藻屬于綠藻門(Chlorophyta)還是黃藻門(Xanthophyta)存在爭議，而基于18S核糖體核糖核酸(18S ribosomal ribonucleic acid，18S rRNA)序列的分子系統發育學研究結果將布朗葡萄藻界定為綠藻門、共球藻綱(Trebouxiophyceae)。依據藻株的產烴種類和化學結構特征，可將布朗葡萄藻劃分為A、B和L 3個化學種，而布朗葡萄藻的分子系統學進化關系與化學種間高度統一。在基因組大小上，位于同一大亞聚群中的化學種B與L間卻存在明顯差異，而進化關系較遠的化學種B與A間則更相近。不同地理來源布朗葡萄藻的18S rRNA序列和內部轉錄間隔區(internal transcribed spacer，ITS)多態性較高，提示不同地緣藻株間存有較高的遺傳多樣性。探討了布朗葡萄藻分子生態學研究尚待解決的問題，并對今后相關研究做了展望。

布朗葡萄藻; 形態學; 化學種; 分子生態學; 分子系統發育學

布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)因其脂質含量高、不占用耕地及可利用CO2光合產烴等優勢，成為具有重大開發潛力的能源微藻之一[1]。布朗葡萄藻具有梨形單細胞、串狀集落等典型形態特征，富含烴類和脂肪酸等代謝產物[2- 3]。其主要烴類組成與化學結構等常因藻株不同而存在明顯差異，一般可據此分為A、B和L 3個化學種[4- 6]。然而，由于布朗葡萄藻的形態特征和生化組分等易受環境因素影響[7- 11]，利用以形態學為主要依據的經典分類學界定布朗葡萄藻時往往會存在較大難度與爭議。

隨著分子生物學與生態學的相互滲透和發展，分子生態學應運而生[12- 13]。分子生態學應用分子生物學的原理和方法，使生態學研究從表觀特征觀察深入到生物體內各種生物活性分子以及這些分子與環境相互作用的機制，進而以宏觀與微觀緊密結合的角度反映生態系統中生物個體和種群間關系的本質[14- 15]。近年來，相關分子生態學研究在揭示布朗葡萄藻的分類地位、遺傳多樣性及系統演化等方面不斷發展，并取得了一定成果。本文在簡述布朗葡萄藻形態學與化學種特征的基礎上，著重介紹其分子生態學研究的最新進展，并對今后面臨的挑戰與研究動向進行探討與展望。

1 布朗葡萄藻的生理生態特性

1.1 形態學特征

布朗葡萄藻是一種單細胞光合微藻，廣泛分布于世界熱帶、亞熱帶和溫帶的淡水和微咸水等水域中[16]，其典型形態學特征為：單細胞呈梨形，長7—13 μm，寬5—9 μm，具有一個裸露蛋白核、細胞核、葉綠體、淀粉核等；基質外壁富含脂質，使各單細胞呈輻射狀聚成串狀集落[1, 8, 17- 18]。在我國淡水藻志及一些其他研究中，認為布朗葡萄藻具有綠藻門(Chlorophyta)的本征性，隸屬于綠藻門、綠藻綱(Chlorophyceae)、綠球藻目(Chlorococcales)、葡萄藻科(Botryococcaceae)、葡萄藻屬(Botryococcus)[17, 19- 20]；而根據其質體和淀粉粒的結構，胡鴻鈞和魏印心[21]、Smith[22]等建議將其歸入黃藻門(Xanthophyta)、黃藻綱(Xanthophyeeae)。布朗葡萄藻的形態結構不僅在不同藻株之間存在差異，即使同一藻株的不同培養條件和生長階段也有所不同。由于布朗葡萄藻的形態結構易受溫度、pH、光照等環境條件的影響[7- 11]，使得以形態學為基礎的經典分類學鑒定工作的難度大為增加，且鑒定結果也易引起爭議。因此，經典分類學在布朗葡萄藻藻種的分類、鑒定上存在較大局限性，還須結合分子生態學等彌補其局限和不足。

1.2 化學種類及其特征

根據其烴類化學結構性質的不同，可以將布朗葡萄藻分為A、B和L 3個化學種[4- 6, 23- 25]。(1)化學種A：主要合成無分枝、直鏈、奇數碳鏈C23—C33的n-二烯烴、三烯烴，其中二烯烴含量較多。(2)化學種B：主要合成不飽和的三萜類烯烴(CnH2n-10,n=30—37)，包括C30—C37的葡萄烯和C31—C34的甲基鯊烯等[26]，其中葡萄烯含量較多，通常能占到細胞干重的27%—86%。(3)化學種L：僅合成一種分枝上存在苯環或雜環的四萜類烯烴(C40H78)，含量為細胞干重的2%—8%。在上述3個化學種中，葡萄藻所含脂質均是石油和煤的主要組成成分[27- 29]。其中，化學種A和化學種B的含烴量相對較高，在作為烴類燃料的生產上要優于化學種L。在實驗室培養條件下，和化學種L相比，化學種A、B的細胞通常較大；而且，在穩定生長期，化學種A常呈綠色或淺黃色，而化學種B、L則呈桔紅或桔褐色[8, 30]。因此，葡萄藻的這些特定形態特征可用于其化學種的初步判斷。

此外，Templier等[31]發現另一種化學種Gb的二烯烴與化學種A相似，但烯鍵同時存在順式和反式；Kawachi等[32]報道發現了含有C18—C20環氧樹脂正烷烴的新化學種S。可見，隨著研究的深入，布朗葡萄藻的化學分類正得以不斷地補充和完善。

2 布朗葡萄藻的分子生態學研究

2.1 分子系統發育學研究

基于形態特征的經典分類學是現代生物分類學的基礎。隨著分子系統學研究策略及分析手段的日益完善，植物分類學領域在注重傳統經典分類學的同時，加強了以蛋白質、核酸等為證據的分子系統學研究[33]，以期對經典分類學起到驗證和補充的作用。布朗葡萄藻的形態、生理生化等表型特征在外界因素的影響下容易發生變化，但這種表型特征在本質上是由藻株的基因型所決定的。因此，直接反映基因型的分子數據是研究系統發育關系的理想標記，是進行基因分型和遺傳多樣性研究的良好位點。

分子系統發育學研究有兩大分子標記，即蛋白質與核酸[34- 35]。蛋白質是分子系統學研究中最早應用的分子，隨著聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增及自動測序技術的發展，核酸測序分析逐漸成為闡明系統演化關系最為有效的方法。在核酸測序分析中，常用于分子系統發育學研究的基因片段包括：核基因片段18S rRNA序列、ITS序列等，葉綠體基因片段1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶基因(1,5-bisphosphate carboxynase/ oxygenase large subunit gene，rbcL)等，以及線粒體基因片段等[36- 38]。目前，布朗葡萄藻的分子系統發育學研究主要利用核基因18S rRNA與ITS區，及葉綠體基因rbcL序列構建系統發育樹進行相應的系統分析，從基因水平闡明其分類地位、遺傳多樣性及系統演化等。

經與其他微藻核糖體小亞基 RNA 序列[39]比對分析，Sawayama等[40]建立了第一個針對布朗葡萄藻的系統發育樹，發現布朗葡萄藻B.brauniiKützing(Berkeley；化學種B)屬于綠藻門、綠藻綱，同小樁藻(Characiumvaculatum)和巴夫杜氏藻(Dunaliellaparva)親緣較近。Senousy等[41]構建了布朗葡萄藻不同化學種藻株與53個綠藻門藻株的18S rRNA序列系統發育樹，發現布朗葡萄藻屬于綠藻門、共球藻綱(Trebouxiophyceae)，并與共球藻綱的Choricystis親緣關系最近。上述結果有力支持了布朗葡萄藻屬于綠藻門的觀點，但對其所屬綱別仍存在分歧。

Weiss等[42]針對B.brauniiBerkeley藻株重建了18S rRNA序列系統發育樹，并通過布朗葡萄藻β-肌動蛋白的互補脫氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid，cDNA)序列系統發育樹來驗證其結果，認定B.brauniiBerkeley屬于共球藻綱。國內王朋云等[43]利用綠球藻目(Chioroeoeeales)、柄球藻目(Misehoeoceales)、衣藻目(ehiamydomonadales)和小球藻目(Chiorellales)的rbcL序列構建了系統發育樹，同樣發現布朗葡萄藻株與共球藻綱、小球藻目的藻株同屬一大簇群。因此，分子系統發育樹證實布朗葡萄藻屬綠藻門、共球藻綱，為澄清其經典分類學上的爭議提供了強有力的分子證據。

2.2 分子系統發育關系與化學種的關聯性

Kawachi等[32]根據氣相色譜-質譜分析結果，以鄰接法(Neighbor joining，NJ)、最大簡約法(Maximum parsimony，MP)和最大似然法(Maximum likelihood，ML)將其分離的31個布朗葡萄藻藻株分為4個化學種(包括已知化學種A、B、L和新化學種S)，并與GenBank上其他布朗葡萄藻株共同構建了基于18S rRNA序列的系統發育樹(圖1)[32]，形成3個主聚群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，依次分別與化學種A、B、L相對應；其中，主聚群Ⅱ、Ⅲ又分別形成亞聚群Ⅱ1、Ⅱ2和Ⅲ1、Ⅲ2，而亞聚群Ⅲ1、Ⅲ2分別對應于化學種L、S。

圖1 基于18S rRNA序列的布朗葡萄藻序列系統發育樹[32]

為進一步探討布朗葡萄藻分子系統發育與其所屬化學種之間的關系，筆者從GenBank中獲取了更多已知化學種類型的布朗葡萄藻的18S rRNA序列[32, 41- 42]，并利用MEGA 5.05 軟件以鄰接法NJ、最大簡約法MP和最大似然法ML構建了分子系統發育樹(圖2)?？芍?，化學種A、B、L均屬共球藻綱這個大分枝，其下分成兩個譜系，分別由化學種A和化學種B、L組成。這可能與其產烴類型存在關聯性，即化學種B、L產生的烴類均以類異戊二烯烴為組成單位，而化學種A主要合成二烯烴[41]。這一結果驗證和補充了布朗葡萄藻的化學種分類，同時揭示其分子系統發育關系與化學種之間存在較高的關聯性。

圖2 基于18S rRNA序列的布朗葡萄藻系統發育樹[32, 41- 42]

2.3 進化關系與基因組大小間的相關性

布朗葡萄藻化學種B、L在18S rRNA序列的系統發育樹中屬于同一譜系，即二者存在較近的進化關系，然而其基因組大小卻存在明顯差異。Weiss等[42- 43]測得分屬化學種A、B、L的3株藻的基因組大小依次為166.0Mb、166.2Mb和211.3Mb?？梢姡瑢儆谕蛔V系中的化學種B、L的基因組大小差距顯著，而進化關系較遠的化學種A、B的基因組大小反而很接近，這提示有關布朗葡萄藻化學種間的進化關系還需作更深入地探究。最近，Molnár等[44]利用已測序化學種B(B.brauniiShowa)的一個轉錄組，構建了其主要烴類的生物合成網絡，為揭示不同化學種與其主要烴類生物合成網絡的聯系提供了重要啟示。相信隨著其他化學種布朗葡萄藻基因組的測定和注釋，將為揭示布朗葡萄藻不同化學種進化關系及其相應基因組特性的內在關聯等提供更全面的信息。

2.4 親緣關系、遺傳多樣性與地理來源間的關聯性

布朗葡萄藻的系統發生樹通常由兩大簇群組成，而每個族群又可進一步細分為不同的亞簇，表明該藻的18S rRNA、ITS序列位點具有較高的遺傳多態性，不同藻株之間存在遺傳上的多樣性[45]。由于布朗葡萄藻廣泛分布于世界各地，其較高的遺傳多樣性可能由一定程度的地理隔離所致。王朋云等[45- 46]以與布朗葡萄藻同科但不同屬的南向球葡萄藻(Botryosphaerellasudetica UTEX 2629)的18S rRNA、ITS等序列為外群構建了布朗葡萄藻系統發育樹，比較了不同地理來源的布朗葡萄藻親緣關系的遠近程度。18S rRNA的系統發育樹結果表明，采自我國云南撫仙湖的藻株(B.brauniiAGB-Bb02)與采自湖北武漢的藻株(B.brauniiAGB-Bb03)屬于同一簇群，分別與源自泰國的藻株(B.brauniiSongkla Nakarin)和源于非洲科特迪瓦的藻株(B.brauniiAyame)的遺傳親緣關系較近；而采自英國劍橋的藻株(B.brauniiAGB-Bb01)則屬于另一簇群，與源于玻利維亞的藻株(B.brauniiTiticaca)和美國明尼蘇達的藻株(B.brauniiTow 9/21 P- 16w)親緣關系較近，其遺傳距離分別為0.0098和0.0116。在ITS系統發育樹中，AGB-Bb01與源于澳大利亞新南威爾士的藻株(B.brauniiJillamatong)親緣關系最近，與源自英國坎布里亞的藻株(B.brauniiCCAP807/2)和科特迪瓦藻株(B.brauniiYamoussoukro)親緣關系最遠。此外，Kawachi等[32]構建的基于18S rRNA序列的布朗葡萄藻系統發育樹發現，一些采自同一地域的藻株也會處于不同的系統位置上。這種差異可能是由某些攝食微藻的鳥類通過覓食、遷徙等攜帶布朗葡萄藻傳播的結果[47- 48]。布朗葡萄藻的遺傳多樣性與地理來源之間的聯系性尚需更多實地檢測和更充足的種質資源測序分析等進一步考察。

3 問題與展望

近年來，分子生態學作為一門新興學科，為生態學研究提供了嶄新的角度和思路，它通過宏觀與微觀的結合，在闡釋生命系統與環境系統相互作用的機理及其分子機制中發揮著越來越重要的作用。較其他某些藻類而言，布朗葡萄藻的分子生態學研究起步較晚，面臨一些問題和挑戰：(1)現有布朗葡萄藻分子系統發育學研究使用的分子標記主要集中于單一的DNA序列片段上，今后相關研究所選擇的DNA分子標記應趨向于多片段、長序列，以期獲得更加充足的分子數據信息，從而更全面地反映其系統發育關系[36]。(2)在布朗葡萄藻18S rRNA的系統發育樹中，同一譜系的化學種B、L比化學種A存在更近的進化關系，這與它們的產烴種類存在一定關聯性；但不同化學種的進化關系與其相應基因組大小的關系相反[42- 43]。布朗葡萄藻3個化學種之間存在怎樣的進化關系，其基因組與主要烴類生物合成網絡之間存在怎樣的調控與反饋機制，這些問題的闡釋需要對不同化學種的基因組進行更深入地測定分析。(3)布朗葡萄藻的遺傳多樣性是否由地理隔離引起[45- 46]，其遺傳多樣性與地理來源之間存在怎樣的相關性,這需要在更多實地考察和更充足的源于不同地域藻株分子數據信息的基礎上深入論證。

與經典分類學研究一樣，分子系統發育學也有自身的一些局限性[35]。布朗葡萄藻分子系統發育學研究只有將核酸與蛋白質數據綜合起來建立更為完善的系統發育樹，再與經典分類、化學分類相互結合印證，逐步建立整體體系，才能更深入準確地闡明其系統發育關系。同時，基因組和蛋白質組序列測定及相應生物信息學的迅猛發展，不僅促進有關布朗葡萄藻烴類合成的基因工程、系統基因組學和蛋白組學的興起，而且將從微觀水平上更真實直接地闡明生態現象的分子機理，從而推進布朗葡萄藻分子生態學研究及能源微藻產業化進程。

[1] Metzger P, Largeau C.Botryococcusbraunii: a rich source for hydrocarbons and related ether lipids. Applied Microbiology and Biotechnology, 2005, 66(5): 486- 496.

[2] Brown A C, Knights B A, Conway E. Hydrocarbon content and its relationship to physiological state in the green algaBotryococcusbraunii. Phytochemistry, 1969, 8(3): 543- 547.

[3] Knights B A, Brown A C, Conway E, Middleditch B S. Hydrocarbons from the green form of the freshwater algaBotryococcusbraunii. Phytochemistry, 1970, 9(6): 1317- 1324.

[4] Metzger P, Berkaloff C, Casadevall E, Coute A. Alkadiene- and botryococcene-producing races of wild strains ofBotryococcusbraunii. Phytochemistry, 1985, 24(10): 2305- 2312.

[5] Huang Z, Dale Poulter C. Tetramethylsqualene, a triterpene fromBotryococcusbrauniivarshowa. Phytochemistry, 1989, 28(5): 1467- 1470.

[6] Metzger P, Allard B, Casadevall E, Berkaloff C, Couté A. Structure and chemistry of a new chemical race ofBotryococcusbrauniithat produces lycopadiene, a tetraterpenoid hydrocarbon. Journal of Phycology, 1990, 26(2): 258- 266.

[7] Plain N, Largeau C, Derenne S, Couté A. Variabilité morphologique deBotryococcusbraunii(Chlorococcales, Chlorophyta): corrélations avec les conditions de croissance et la teneur en lipides. Phycologia, 1993, 32(4): 259- 265.

[8] 馬梅. 布朗葡萄藻烴成分分析, 培養條件優化及不同時期的形態結構比較 [D]. 青島: 中國海洋大學, 2008.

[9] 胡章喜, 安民, 段舜山, 徐寧, 孫凱峰, 劉曉娟, 李愛芬, 張成武. 不同氮源對布朗葡萄藻生長、總脂和總烴含量的影響. 生態學報, 2009, 29(6): 3288- 3294.

[10] Tanoi T, Kawachi M, Watanabe M M. Effects of carbon source on growth and morphology ofBotryococcusbraunii. Journal of Applied Phycology, 2011, 23(1): 25- 33.

[11] Ruangsomboon S. Effect of light, nutrient, cultivation time and salinity on lipid production of newly isolated strain of the green microalga,BotryococcusbrauniiKMITL 2. Bioresource Technology, 2012, 109: 261- 265.

[12] 胡志昂, 王洪新. 分子生態學研究進展. 生態學報, 1998, 18(6): 565- 574.

[13] 張愛兵, 譚聲江, 陳建, 李典謨. 空間分子生態學——分子生態學與空間生態學相結合的新領域. 生態學報, 2002, 22(5): 752- 769.

[14] 黃勇平, 朱湘雄. 分子生態學——生命科學領域的新學科. 中國科學院院刊, 2003, 18(2): 84- 88.

[15] Krüger M, Krüger C, Walker C, Stockinger H, Schü?ler A. Phylogenetic reference data for systematics and phylotaxonomy of arbuscular mycorrhizal fungi from phylum to species level. New Phytologist, 2012, 193(4): 970- 984.

[16] Wake L V, Hillen L W. Study of a “bloom” of the oil-rich algaBotryococcusbrauniiin the Darwin River Reservoir. Biotechnology and Bioengineering, 1980, 22(8): 1637- 1656.

[17] Noguchi T, Kakami F. Transformation oftrans-Golgi network during the cell cycle in a green alga,Botryococcusbraunii. Journal of Plant Research, 1999, 112(2): 175- 186.

[18] Komárek J, Komárková-Legnerová J. Review of the EuopeanMicrocystis-morphospecies (Cyanoprokaryotes) from nature. Czech Phycology, 2002, 2: 1- 24.

[19] 畢列爵, 胡征宇. 中國淡水藻志(第八卷). 北京: 科學出版社, 2004: 111- 115.

[20] Hirose H, Ogasawara N. Fine structural evidence for the systematic position ofBotryococcusbrauniiKützing as a member of Chlorophyceae. Bulletin of the Japanese Society of Phycology, 1977, 25: 61- 69.

[21] 胡鴻鈞, 魏印心. 中國淡水藻類—系統、分類及生態. 北京: 科學出版社, 2006: 286- 286.

[22] Smith G M. The Fresh-Water Algae of the United States. New York: McGraw-Hill, 1950: 716- 716.

[23] Villarreal-Rosales E, Metzger P, Casadevall E. Ether lipid production in relation to growth inBotryococcusbraunii. Phytochemistry, 1992, 31(9): 3021- 3027.

[24] Metzger P, Casadevall E. Structure de trois nouveaux “botryococcenes” synthetises par une souche deBotrycoccusbrauniicultivee en laboratoire. Tetrahedron Letters, 1983, 24(37): 4013- 4016.

[25] Metzger P, Casadevall E. Lycopadiene, a tetraterpenoid hydrocarbon from new strains of the green algaBotryococcusbraunii. Tetrahedron Letters, 1987, 28(34): 3931- 3934.

[26] Achitouv E, Metzger P, Rager M N, Largeau C. C31-C34methylated squalenes from a Bolivian strain ofBotryococcusbraunii. Phytochemistry, 2004, 65(23): 3159- 3165.

[27] Glikson M, Lindsay K, Saxby J.Botryococcus—A planktonic green alga, the source of petroleum through the ages: transmission electron microscopical studies of oil shales and petroleum source rocks. Organic Geochemistry, 1989, 14(6): 595- 608.

[28] Summons R E, Metzger P, Largeau C, Murray A P, Hope J M. Polymethylsqualanes fromBotryococcusbrauniiin lacustrine sediments and crude oils. Organic Geochemistry, 2002, 33(2): 99- 109.

[29] Adam P, Schaeffer P, Albrecht P. C40monoaromatic lycopane derivatives as indicators of the contribution of the algaBotryococcusbrauniirace L to the organic matter of Messel oil shale (Eocene, Germany). Organic Geochemistry, 2006, 37(5): 584- 596.

[30] 徐玲. 布朗葡萄藻的培養優化與分離技術 [D]. 南京: 江南大學, 2011.

[31] Templier J, Largeau C, Casadevall E. Non-specific enlongation-decarboxylation in biosynthesis ofcis- andtrans-alkadienes byBotryococcusbraunii. Phytochemistry, 1991, 30(1): 175- 183.

[32] Kawachi M, Tanoi T, Demura M, Kaya K, Watanabe M M. Relationship between hydrocarbons and molecular phylogeny ofBotryococcusbraunii. Algal Research, 2012, 1(2): 114- 119.

[33] 萬海清, 梁明山, 許介眉. 分子生物學手段在植物系統與進化研究中的應用. 植物學通報, 1998, 15(4): 8- 17.

[34] 程燕林, 梁軍, 呂全, 張星耀. 葡萄座腔菌科研究進展——鑒定, 系統發育學和分子生態學. 生態學報, 2011, 31(11): 3197- 3207.

[35] Edwards S V. Is a new and general theory of molecular systematics emerging? Evolution, 2009, 63(1): 1- 19.

[36] Olson P D, Tkach V V. Advances and trends in the molecular systematics of the parasitic Platyhelminthes. Advances in Parasitology, 2005, 60: 165- 243.

[37] Wolfe A D, Randle C P. Recombination, heteroplasmy, haplotype polymorphism, and paralogy in plastid genes: implications for plant molecular systematics. Systematic Botany, 2004, 29(4): 1011- 1020.

[38] Subramaniam S, Pandey A K, Geeta R, Mort M E. Molecular systematics of IndianCrotalaria(Fabaceae) based on analyses of nuclear ribosomal ITS DNA sequences. Plant Systematics and Evolution, 2013, 299(6): 1089- 1106.

[39] Gunderson J H, Elwood H, Ingold A, Kindle K, Sogin M L. Phylogenetic relationships between chlorophytes, chrysophytes and oomycetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1987, 84(16): 5823- 5827.

[40] Sawayama S, Inoue S, Yokoyama S Y. Phylogenetic position ofBotryococcusbraunii(Chlorophyceae) based on small subunit of ribosomal RNA sequence data. Journal of Phycology, 1995, 31(3): 419- 420.

[41] Senousy H H, Beakes G W, Hack E. Phylogenetic placement ofBotryococcusbraunii(Trebouxiophyceae) andBotryococcussudeticusisolate UTEX2629 (Chlorophyceae). Journal of Phycology, 2004, 40(2): 412- 423.

[42] Weiss T L, Spencer Johnston J, Fujisawa K, Sumimoto K, Okada S, Chappell J, Devarenne T P. Phylogenetic placement, genome size, and GC content of the liquid-hydrocarbon-producing green microalgaBotryococcusbrauniistrain Berkeley (Showa) (Chlorophyta). Journal of Phycology, 2010, 46(3): 534- 540.

[43] Weiss T L, Spencer Johnston J, Fujisawa K, Okada S, Devarenne T P. Genome size and phylogenetic analysis of the A and L races ofBotryococcusbraunii. Journal of Applied Phycology, 2011, 23(5): 833- 839.

[44] Molnár I, Lopez D, Wisecaver J H, Devarenne T P, Weiss T L, Pellegrini M, Hackett J D. Bio-crude transcriptomics: Gene discovery and metabolic network reconstruction for the biosynthesis of the terpenome of the hydrocarbon oil-producing green alga,Botryococcusbrauniirace B (Showa). BioMed Central Genomics, 2012, 13: 576- 576.

[45] 王朋云, 茅云翔, 孔凡娜, 馬梅, 馬飛. 叢粒藻形態多樣性與遺傳多樣性研究. 中國海洋大學學報: 自然科學版, 2011, 41(5): 63- 70.

[46] 王朋云. 叢粒藻形態多樣性、遺傳多樣性分析與培養條件優化 [D]. 青島: 中國海洋大學, 2010.

[47] 馮建祥, 黃敏參, 黃茜, 郭婕敏, 林光輝. 穩定同位素在濱海濕地生態系統研究中的應用現狀與前景. 生態學雜志, 2013, 32(4): 1065- 1074.

[48] Kwak T J, Zedler J B. Food web analysis of southern California coastal wetlands using multiple stable isotopes. Oecologia, 1997, 110(2): 262- 277.

Advances in molecular ecology of the oil-rich microalgaBotryococcusbraunii

MA Lifang, LIU Junzhi, LIU Xinying, WANG Zhiping*, CHEN Ziyuan

KeyLaboratoryofChineseMinistryofAgricultureforNuclear-AgriculturalSciences,InstituteofNuclear-AgricultureSciencesofZhejiangUniversity,Hangzhou310029,China

Molecular ecology is defined as a science that studies interactions between life system and environmental system, as well as the corresponding molecular mechanisms. By combining macro and micro aspects, molecular ecology could reflect the nature of ecological phenomena. The green microalgaBotryococcusbrauniiis well known for its ability to accumulate large amounts of hydrocarbon, and it is attractive as a potential resource for renewable biofuel production. This review, on the base of briefly introducing the physio-ecological characteristics ofB.brauniiconcerning morphology and chemical race, mainly addresses the up-to-date achievements of molecular ecology including molecular phylogeny and its relationship with chemical race, genome size and original geographical position. Morphologically,B.brauniiis characterised by a botryoid organization of individual pyriform-shaped cells, held together by a refringent matrix containing lipids. In classical taxonomy mainly referring to morphology structures, it is difficult to identify whetherB.brauniiis a member of Chlorophyta or Xanthophyta, Recently, the molecular phylogenetic results based on 18S rRNA analysis clarified that this alga belongs to Trebouxiophyceae (Chlorophyta). According to the differences of the produced hydrocarbon, at least three chemical races ofB.brauniicould be identified, respectively named as Race A, B and L. Race A produces essentially odd-numbered n-alkadiene and triene hydrocarbons from C23to C33; race B produces triterpenoid hydrocarbons (CnH2n-10,n=30—37), including C30—C37botryococcenes and C31—C34methylated squalenes; by contrast, the hydrocarbon product of the race L involves one single C40tetraterpenoid hydrocarbon, lycopadiene. In addition, the molecular phylogenetic analyses ofB.brauniibased on 18S rRNA gene sequences shows high consistency between the established phylogeny and the chemical races; meanwhile, there seems to be some correspondence between the alga evolutionary relationship and the hydrocarbon products. On the genomic level, the genome size is similar in race B (166.2Mb) and race A (166.0Mb) which are in far evolutionary relationships, whereas it exists significant differences between race B and race L (211.3Mb) which are from the same cluster. The significance of this discrepancy in terms of how these chemical races diverged is not clear at this time. Moreover, genetic relationship of this alga strain originally isolated from different geographical locations is established by molecular phylogenetic analysis, indicating both high genetic diversity in alga strains and high genetic polymorphism in DNA segments. To conclude, this review discusses some deficiency in the present research and suggests several critical issues that need further study. For instance, the genome and proteome ofB.brauniito reconstruct main metabolic pathways which are responsible for lipid production should be sequenced. These finding will definitely aid in directly clarifying the molecular mechanisms of ecological phenomena, thus benefit both the theory development in molecular ecology and the practice process for alga-oil production.

Botryococcusbraunii; morphology; chemical race; molecular ecology; molecular phylogenetics

國家公益性行業(農業)科研專項(201103007); 國家高技術研究發展(863)計劃課題(2012AA050101); 國家自然科學基金項目(10975118); 浙江省院士基金項目(J20110445, D20130018)

2013- 08- 23;

2014- 05- 30

10.5846/stxb201308232132

*通訊作者Corresponding author.E-mail: zhpwang@zju.edu.cn

馬麗芳, 劉俊稚, 劉新穎, 汪志平, 陳子元.富油微藻布朗葡萄藻分子生態學研究進展.生態學報,2015,35(10):3165- 3171.

Ma L F, Liu J Z, Liu X Y, Wang Z P, Chen Z Y.Advances in molecular ecology of the oil-rich microalgaBotryococcusbraunii.Acta Ecologica Sinica,2015,35(10):3165- 3171.