番茄紅素對實驗性糖尿病大鼠腎臟保護作用的研究

張海峰

(冀中能源峰峰集團有限公司總醫(yī)院，河北 邯鄲 056200)

番茄紅素對實驗性糖尿病大鼠腎臟保護作用的研究

張海峰

(冀中能源峰峰集團有限公司總醫(yī)院，河北 邯鄲 056200)

[摘要]目的 研究番茄紅素(Lycopene,LP)對實驗性糖尿病大鼠腎臟的保護作用。方法 首先通過高脂高糖飲食飼養(yǎng)8周后腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)方法制備糖尿病大鼠模型，將造模成功的80只大鼠隨機分為模型組、番茄紅素5 mg/kg組、番茄紅素10 mg/kg組、番茄紅素20 mg/kg組和鹽酸二甲雙胍組，每組16只。另取16只健康大鼠作為正常對照組。正常對照組和模型組連續(xù)灌胃生理鹽水，番茄紅素各組和鹽酸二甲雙胍組分別連續(xù)灌胃相應(yīng)劑量番茄紅素和鹽酸二甲雙胍(200 mg/kg)，每天1次，連續(xù)28 d。分別于給藥前和給藥后第7,14,28天測定各組大鼠胰島素和空腹血糖水平。給藥28 d后，觀察各組大鼠一般狀況，測定各組大鼠體質(zhì)量、腎臟指數(shù)、24 h尿量、24 h尿蛋白量(UPro)及血尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、尿酸(UA)水平；測定各組大鼠腎臟組織中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量；通過PAS染色觀察腎臟組織病理形態(tài)學(xué)變化；通過TUNEL染色觀察腎小球細胞凋亡狀況，并計算凋亡指數(shù)(AI)。結(jié)果 番茄紅素各組大鼠一般狀況得到明顯改善，其中以20 mg/kg組效果最為顯著。番茄紅素10 mg/kg組灌胃第28天胰島素水平明顯高于模型組，番茄紅素20 mg/kg組灌胃第14,21,28天胰島素水平均明顯高于模型組。番茄紅素20 mg/kg組灌胃第21,28天空腹血糖水平均顯著低于模型組。番茄紅素10 mg/kg組和番茄紅素20 mg/kg組大鼠體質(zhì)量顯著高于模型組，腎臟指數(shù)、尿量、UPro及血清BUN、SCr、UA水平均顯著低于模型組；腎臟組織中SOD活性顯著高于模型組，MDA含量顯著低于模型組，其中番茄紅素20 mg/kg組GSH-Px活性顯著高于模型組。番茄紅素各組大鼠腎臟組織病理形態(tài)學(xué)改變和腎臟組織細胞凋亡狀況均明顯改善，其中以20 mg/kg組效果最為顯著；并且番茄紅素10 mg/kg組和番茄紅素20 mg/kg組大鼠腎小球細胞凋亡指數(shù)顯著低于模型組。結(jié)論 番茄紅素對實驗性糖尿病大鼠腎臟組織具有保護作用。

番茄紅素；糖尿病；大鼠；腎臟保護

長期血糖控制不佳的糖尿病患者常伴有多個組織器官的并發(fā)癥，其中腎臟損傷是糖尿病患者致殘、甚至致死的主要原因。因此，在有效維持血糖水平的同時，還應(yīng)積極控制糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生[1-2]。番茄紅素(Lycopene，LP)是一種廣泛存在于番茄、胡蘿卜、西瓜等紅色蔬菜水果中的類胡蘿卜素，具有良好的抗氧化、抗腫瘤、增強機體免疫力等藥理學(xué)作用[3-5]。本實驗采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周加腹腔注射STZ破壞胰島細胞的方法制備的糖尿病大鼠模型，研究了番茄紅素對糖尿病大鼠腎臟組織的保護作用。現(xiàn)報道如下。

1 實驗資料

1.1試驗藥物與試劑 番茄紅素(南京澤朗生物科技有限公司，純度≥96%，批號：ZL201401082a)；鹽酸二甲雙胍購自河北天成藥業(yè)股份有限公司(批號：20140721)；24 h尿蛋白量(UPro)、血尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、尿酸(UA)測定試劑盒購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；胰島素酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測試劑盒購自美國密理博公司；PAS、TUNEL染色試劑盒購自北京博奧森公司；STZ購自美國Sigma公司；烏拉坦購自北京化學(xué)試劑公司。

1.2 動物 SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由河北省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(冀)2008-1-003；飼養(yǎng)環(huán)境：室溫22～25 ℃，相對濕度65%～70%，光照周期12 h∶12 h。

1.3 儀器 血糖儀(羅氏)；BS-300型全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；UV-1800型紫外分光光度計(日本島津公司)；CUT4062型石蠟切片機(德國SLEE公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；24D臺式高速離心機(深圳市賽泰克生物科技有限公司)；BL200S電子天平(美國SETRA公司)。

1.4 方法

1.4.1 模型的制備與分組 實驗用大鼠經(jīng)高脂高糖飲食8周后，經(jīng)連續(xù)2 d腹腔注射STZ[30 mg/(kg·d)]破壞胰島細胞制備糖尿病大鼠模型，分別于72 h和3 d后通過血糖儀測定空腹血糖水平，持續(xù)高于16.7 mmol/L即認定為造模成功；選取造模成功的80只大鼠，隨機分為模型組、番茄紅素5 mg/kg組、番茄紅素10 mg/kg組、番茄紅素20 mg/kg組和鹽酸二甲雙胍組，每組16只。另取16只健康大鼠作為正常對照組。正常對照組和模型組連續(xù)灌胃生理鹽水，番茄紅素各組和鹽酸二甲雙胍組分別連續(xù)灌胃相應(yīng)劑量番茄紅素和鹽酸二甲雙胍(200 mg/kg)，每天1次，連續(xù)28 d。

1.4.2 各組大鼠一般狀況的觀察 灌胃28 d后，觀察大鼠精神狀態(tài)、外觀、飲食、體質(zhì)量情況。

1.4.3 胰島素和空腹血糖水平測定 分別于灌胃前和灌胃后第7，14，21，28天由尾靜脈取血，按照胰島素ELISA試劑盒操作方法步驟平行測定各組大鼠胰島素水平，并通過血糖儀平行測定各組大鼠空腹血糖水平并記錄。

1.4.4 體質(zhì)量及腎臟指數(shù)測定 灌胃28 d后，分別稱量各組大鼠體質(zhì)量；腹腔注射烏拉坦實施麻醉，開腹取腎臟組織，用生理鹽水沖洗并用濾紙吸干后，稱量左側(cè)腎臟質(zhì)量，計算腎臟指數(shù)：腎臟指數(shù)=左側(cè)腎臟質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.4.5 尿量及UPro測定 干預(yù)28 d后，測定各組大鼠24 h尿量，并通過磺基水楊酸法測定分析測定各組大鼠UPro值。

1.4.6 血清BUN、SCr、UA水平測定 灌胃28 d后，腹腔注射烏拉坦實施麻醉，開腹經(jīng)腹主動脈取血，1 500 r/min離心10 min后取血清，嚴格按照測定試劑盒說明書操作方法，通過生化分析儀平行測定各組大鼠血清BUN、SCr、UA水平。

1.4.7 腎臟組織中SOD、GSH-Px活性和MDA含量的測定經(jīng)1.4.4所取右側(cè)腎臟組織，剪碎后加入適量冷裂解液進行研磨勻漿，3 000 r/min離心10 min后取上層液，按照試劑盒操作方法，通過紫外-可見分光度計測定各組大鼠腎臟組織中SOD、GSH-Px活性和MDA含量。

1.4.8 腎臟組織病理形態(tài)學(xué)觀察 經(jīng)1.4.4稱量后的左側(cè)腎臟組織置于4%的多聚甲醛溶液中進行固定，經(jīng)石蠟包埋、切片(厚度為5 μm)處理后，進行PAS染色，通過光學(xué)顯微鏡觀察腎臟組織病理形態(tài)學(xué)改變并照相。

1.4.9 腎小球細胞凋亡狀況觀察及凋亡指數(shù)(AI)計算 取1.4.8制備的石蠟切片，按照試劑盒操作方法步驟行TUNEL染色，然后通過光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠腎小球細胞凋亡狀況。每張切片隨機選取5個視野，計數(shù)每個視野中腎小球細胞總數(shù)以及陽性凋亡細胞數(shù)(細胞核黃染為陽性著色，即凋亡細胞)，然后計算凋亡指數(shù)(AI)：AI=(凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般狀況 正常對照組大鼠精神狀態(tài)良好，飲食、飲水及大小便正常，皮毛有光澤，體質(zhì)量逐漸增加；模型組大鼠精神萎靡，出現(xiàn)明顯的“三多一少”癥狀，體質(zhì)量逐漸減輕，體毛枯黃、稀疏；番茄紅素各組大鼠精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，“三多一少”癥狀減輕，體毛光潔，其中番茄紅素20mg/kg組效果最為顯著。

2.2 各組大鼠胰島素水平比較 灌胃后不同時間模型組大鼠胰島素水平均顯著低于正常對照組(P均<0.01)，番茄紅素10mg/kg組灌胃第28天胰島素水平明顯高于模型組(P<0.05)，番茄紅素20mg/kg組灌胃第14,21,28天胰島素水平均明顯高于模型組(P<0.05和P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠灌胃前及灌胃后不同時間胰島素水平比較

注：①與正常對照組比較，P<0.01；②與模型組比較，P<0.05；③與模型組比較，P<0.01。

2.3 各組大鼠空腹血糖水平比較 灌胃后不同時間模型組大鼠空腹血糖水平均顯著高于正常對照組(P均<0.01)；番茄紅素20mg/kg組灌胃第21,28天空腹血糖水平均顯著低于模型組(P<0.05和P<0.01)，鹽酸二甲雙胍組灌胃第14,21,28天空腹血糖水平均顯著低于模型組(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠灌胃前及灌胃后不同時間空腹血糖水平比較

注：①與正常對照組比較，P<0.01；②與模型組比較，P<0.05；③與模型組比較，P<0.01；④與番茄紅素10mg/kg組比較，P<0.05。

2.4 各組大鼠體質(zhì)量、腎臟指數(shù)、尿量和UPro比較 灌胃28d后，與正常對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量顯著減輕，腎臟指數(shù)、尿量和UPro顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)；番茄紅素10mg/kg組和番茄紅素20mg/kg組大鼠體質(zhì)量顯著高于模型組(P<0.05和P<0.01)，腎臟指數(shù)、尿量和UPro均顯著低于模型組(P<0.05和P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠體質(zhì)量、腎臟指數(shù)、尿量和UPro比較

注：①與正常對照組比較，P<0.01；②與模型組比較，P<0.05；③與模型組比較，P<0.01；④與番茄紅素10mg/kg組比較，P<0.05。

2.5 各組大鼠血清BUN、SCr、UA水平比較 灌胃28d后，與正常對照組比較，模型組大鼠BUN、SCr、UA水平均顯著升高(P均<0.01)；番茄紅素10mg/kg組和番茄紅素20mg/kg組血清BUN、SCr、UA水平均顯著低于模型組(P<0.05和P<0.01)，番茄紅素20mg/kg組血清BUN水平明顯低于番茄紅素10mg/kg組(P<0.01)。見表4。

2.6 各組大鼠腎臟組織中SOD、GSH-Px活性和MDA含量比較 與正常對照組比較，模型組大鼠腎臟組織中SOD、GSH-Px活性顯著降低而MDA含量顯著升高(P均<0.01)；與模型組比較，番茄紅素10mg/kg組和番茄紅素20mg/kg組大鼠腎臟組織中SOD活性顯著升高而MDA含量顯著降低(P<0.05和P<0.01)，番茄紅素20mg/kg組GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)。見表5。

2.7 各組大鼠腎臟組織病理形態(tài)學(xué)變化 經(jīng)過PAS染色后觀察發(fā)現(xiàn)，正常對照組大鼠腎臟組織腎小球結(jié)構(gòu)完整，體積未見增大，見圖1；模型組大鼠腎小球體積增大、系膜增生，腎小管上皮細胞呈空泡變性，間質(zhì)區(qū)可見淋巴細胞浸潤，見圖2；番茄紅素各組大鼠腎臟組織病變出現(xiàn)不同程度的改善，其中以20mg/kg組效果最為顯著，見圖3～5；鹽酸二甲雙胍組大鼠腎臟組織病變較模型對照組明顯改善，其效果與番茄紅素20mg/kg組無明顯差異。

表4 各組大鼠血清BUN、SCr、UA水平比較

注：①與正常對照組比較，P<0.01；②與模型組比較，P<0.05；③與模型組比較，P<0.01；④與番茄紅素10mg/kg組比較，P<0.05；⑤與番茄紅素10mg/kg組比較，P<0.01。

表5 各組大鼠腎臟組織中SOD、GSH-Px活性和MDA含量比較

注：①與正常對照組比較，P<0.01；②與模型組比較，P<0.05；③與模型組比較，P<0.01；④與番茄紅素10mg/kg組比較，P<0.05。

圖1 正常對照組大鼠腎臟組織病理學(xué)表現(xiàn)(PAS×400)

圖2 模型組大鼠腎臟組織病理學(xué)表現(xiàn)(PAS×400)

圖3 番茄紅素5 mg/kg組大鼠腎臟組織病理學(xué)表現(xiàn)(PAS×400)

圖4 番茄紅素10 mg/kg組大鼠腎臟組織病理學(xué)表現(xiàn)(PAS×400)

圖5 番茄紅素20 mg/kg組大鼠腎臟組織病理學(xué)表現(xiàn)(PAS×400)

2.8 各組大鼠腎小球細胞凋亡狀況及凋亡指數(shù) 經(jīng)TUNEL染色后觀察發(fā)現(xiàn)，正常對照組大鼠腎臟組織存在極少量凋亡細胞，見圖6；模型組大鼠腎小球細胞凋亡狀況明顯加重，見圖7；番茄紅素各組大鼠腎小球凋亡細胞數(shù)量明顯減少，其中以20mg/kg組最為顯著，見圖8～10；鹽酸二甲雙胍組大鼠腎小球消亡細胞數(shù)明顯減少，但效果不及番茄紅素20mg/kg組顯著，見圖11。模型組、番茄紅素5mg/kg組、番茄紅素10mg/kg組、番茄紅素20mg/kg組和鹽酸二甲雙胍組凋亡指數(shù)分別為(3.7±1.2)%、(52.4±10.6)%、(46.1±12.0)%、(30.5±7.4)%、(16.3±5.2)%、(37.8±9.1)%，模型組凋亡指數(shù)明顯高于正常對照組(P<0.01)，番茄紅素10mg/kg組、番茄紅素20mg/kg組凋亡指數(shù)顯著低于模型組(P<0.05和P<0.01)。

3 討 論

近年來，隨著人們生活水平的提高以及飲食結(jié)構(gòu)的改變，糖尿病的發(fā)病率逐年上升，嚴重危害著人類的生命健康和生活質(zhì)量。隨著病理生理學(xué)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)糖脂代謝異常而導(dǎo)致的氧自由基過剩進而所引發(fā)的廣泛氧化應(yīng)激損傷是糖尿病損傷及其并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的共同通路之一[6]。

圖6 正常對照組大鼠腎小球細胞凋亡狀況(PAS×400)

圖7 模型組大鼠腎小球細胞凋亡狀況(PAS×400)

圖8 番茄紅素5 mg/kg組大鼠腎小球細胞凋亡狀況(PAS×400)

圖9 番茄紅素10 mg/kg組大鼠腎小球細胞凋亡狀況(PAS×400)

圖10 番茄紅素20 mg/kg組大鼠腎小球細胞凋亡狀況(PAS×400)

圖11 鹽酸二甲雙胍組大鼠腎小球細胞凋亡狀況(PAS×400)

番茄紅素是廣泛存在于紅色蔬菜和水果中的一種類胡蘿卜素，具有良好的抗氧化、抗腫瘤等生物活性。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)番茄紅素灌胃28d后，糖尿病大鼠胰島素水平顯著升高，空腹血糖水平顯著降低;體質(zhì)量顯著升高，腎臟指數(shù)、尿量、UPro及血清BUN、SCr、UA水平均顯著降低，其中以番茄紅素20mg/kg組效果最為顯著，提示番茄紅素高劑量可改善糖尿病大鼠腎功能及腎臟組織病理學(xué)改變，抑制腎小球細胞凋亡。

氧自由基能夠在SOD和GSH-Px催化作用下還原生成對人體無害的H2O和O2[7]；MDA為脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，因此腎臟組織中MDA的含量能夠間接反映腎臟組織氧化應(yīng)激損傷程度。本研究發(fā)現(xiàn)，番茄紅素能夠有效提高糖尿病大鼠腎組織中抗氧化酶(SOD、GSH-Px)活性，降低MDA含量，并且高劑量效果好，提示番茄紅素能夠有效抑制糖尿病大鼠腎臟組織氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述，番茄紅素對實驗性糖尿病大鼠腎臟組織具有保護作用。

[1]LapshinaEA,SudnikovichEJ,MaksimchikJZ.Antioxidativeenz-ymeandglutathioneS-transferaseactivitiesindiabeticratsexposedtolong-termASAtreatment[J].LifeSci,2006，79(16):1804-1811

[2]YanS,XuD,ZhangB,etal.Graphembeddingandextensions:ageneralframeworkfordimensionalityreduction[J].IEEETransPatternAnalMachIntell,2007，29(1):40-51

[3] 郭守利,潘洪志,石剛,等. 番茄紅素對糖尿病大鼠血糖及脂質(zhì)過氧化作用的影響[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2003，13(6):340-342

[4]DeStefaniE,BoffettaP,OreggiaF,etal.Plantfoodsandriskoflaryngealcancer:Acase-controlstudyinUraguay[J].IntJcancer,2000,87(1):129-132

[5]Agarwals,RaoAV.Tomatolycopeneandlowdensitylipoproteinoridation:ahumandietaryintervetionstudy[J].Lipids,1998，33(10):981-984

[6]KucukA,YaylakF,Cavunt-BayraktarA,etal.Theprotectiveeffectsofdexmedetomidineonhepaticischemiareperfusioninjury[J].BratislLekListy,2014，115(11):680-684

[7]WidedK,HassibaR,MesbahL.PolyphenolicfractionofAlgerianpropolisreversesdoxorubicininducedoxidativestressinlivercellsandmitochondria[J].PakJPharmSci,2014，27(6):1891-1897

Protective effects of Lycopene on the kidneys in experimental diabetic rats

ZHANG Haifeng

(Jizhong Energy Fengfeng Group Hospital, Handan 056200, Hebei, China)

Objective It is to investigate the protective effects of Lycopene (LP) on the kidneys in experimental diabetic rats. Methods 80 diabetic rat models made by intraperitoneal injecting STZ after feeding with high fat and sugar diet for 8 weeks were randomly divided into 5 groups: model group, LP 5, 10, 20 mg/kg groups and Metformin hydrochloride group, each group had 16 rats. Another 16 same-aged rats were selected as normal control group. Normal control group and model group were given normal saline by intragastric administration, every LP group and Metformin hydrochloride group were treated with respective dosage of LP or Metformin hydrochloride (200 mg/kg) once a day and for 28 days. Before and once week after the drug was given, the levels of insulin and blood sugar were determined. Four weeks later, the general status of the rats were observed; the body weight, renal index(RI), 24 h urine volume, UPro and the content of BUN, SCr, UA in serum were determined; the activity of SOD, GSH-Px and the content of MDA in renal tissue were determined; the renal tissue histo-pathological changes was observed by HE staining; the apoptosis of renal cells was observed by TUNEL staining, and the apoptosis index(AI) was alculated. Results Compared with diabetic model group, the general status of the rats in LP treated groups were improved, especially in 20 mg/kg group the improvements were more significant; the level of insulin in LP 10 mg/kg group was significantly higher than that in model group on the 28th day, while the levels in 20 mg/kg group on the 14th, 21th, 28th day were all higher than that in model group. The blood sugar level of LP 20 mg/kg group was significantly lower than that in model group on the 21th and 28th days; the body weight and SOD activity in LP 10, 20 mg/kg groups were significantly higher, while RI, urine volume, UPro and the levels of serum BUN, SCr, UA, MDA were lower than that in model group. The activity of GSH-Px of LP 20 mg/kg group was significantly higher than that in model group. The histopathological changes and the apoptosis of the renal tissue in LP treated groups were significantly improved, especially in LP 20 mg/kg group the improvements were more significant, and AI of LP 10, 20 mg/kg groups were significantly lower than than in model group. Conclusion LP had dose-dependent protective effects on kidneys in experiment diabetic rats.

Lycopene; diabetes; rat; kidney protection

張海峰，男，主管藥師，從事臨床藥學(xué)研究工作。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.25.009

R-332

A

1008-8849(2015)25-2762-05

2015-04-09