白細胞介素-6-572位點單核苷酸多態性與痰瘀阻肺型、肺腎氣虛型肺脹相關性分析

楊文昊，舒慧敏，劉鳳閣

(1. 湖北醫藥學院附屬人民醫院，湖北 十堰 442000；2. 湖北省丹江口市第一醫院，湖北 丹江口 442700)

白細胞介素-6-572位點單核苷酸多態性與痰瘀阻肺型、肺腎氣虛型肺脹相關性分析

楊文昊1，舒慧敏2，劉鳳閣1

(1. 湖北醫藥學院附屬人民醫院，湖北 十堰 442000；2. 湖北省丹江口市第一醫院，湖北 丹江口 442700)

[摘要]目的 探討白細胞介素-6(IL-6)-572位點單核苷酸多態性與痰瘀阻肺型、肺腎氣虛型肺脹相關性。方法 選取十堰地區漢族肺腎氣虛型肺脹患者78例作為肺腎氣虛型組，痰瘀阻肺型肺脹患者64例作為痰瘀阻肺型組，另選擇同地區漢族健康受試者182例作為對照組。應用聚合酶鏈反應、酶切技術對3組IL-6-572位點單核苷酸多態性進行研究，應用夾心酶聯免疫吸附法測定血清IL-6水平。結果 3組間CC、CG、GG基因型分布情況比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。肺腎氣虛型組和痰瘀阻肺型組血清IL-6水平均高于對照組(P均<0.05)，肺腎氣虛型組和痰瘀阻肺型組比較差異無統計學意義。結論 IL-6-572位點單核苷酸多態性與痰瘀阻肺型、肺腎氣虛型肺脹的發病無明顯相關性。

慢性阻塞性肺疾病；白細胞介素-6；單核苷酸多態性；痰瘀阻肺型；肺腎氣虛型；肺脹

肺脹是多種慢性肺系疾患反復發作，遷延不愈，導致肺氣脹滿、不能斂降的一種病證，其臨床證候特點與西醫學中慢性阻塞性肺疾病(COPD)相類似，痰瘀阻肺型與肺腎氣虛型為肺脹患者常見辨證分型。白細胞介素-6(IL-6)基因啟動子單核甘酸多態性(single nucleotide polymorphisms， SNPs)是近年來研究較多的一個熱點，本研究探討了肺脹患者IL-6-572位點單核苷酸多態性與中醫辨證分型易感性的關系，旨在為肺脹的診治提供更多依據。

1 臨床資料

1.1一般資料 選擇2012年3月—2013年10月在湖北醫藥學院附屬人民醫院就診的十堰地區漢族肺脹患者142例，均為在十堰地區出生并長期居住者，均符合中華醫學會呼吸病學分會《慢性阻塞性肺疾病診治指南》(2007年修訂版)的診斷標準, 并且每名患者均由2名經統一培訓的主治以上職稱的中醫醫師，按照中華中醫藥學會2008年制定的《中醫內科常見病診療指南—中醫病證部分》和2010年全國中醫內科肺系病第十四次學術研討會通過“慢性阻塞性肺疾病中醫診療指南”進行中醫診斷和辨證。其中痰瘀阻肺型患者64例作為痰瘀阻肺型組，肺腎氣虛型肺脹患者78例作為肺腎氣虛型組。另選擇同地區漢族健康體檢者182例作為對照組。所用受試者相互之間均無血緣關系，經詢問病史、體格檢查、胸部X射線胸片或胸部CT及心電圖、血糖等檢查后，排除肺間質纖維化、哮喘等慢性肺部疾病者。本研究經本院倫理委員會審核通過，受試者均對本研究知情同意并簽字。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集 統計入選者性別、年齡、吸煙史及吸煙指數(吸煙指數=平均每天吸煙支數×吸煙年數)，采用Master Screen肺功能儀對患者進行肺功能檢查。

1.2.2 基因型及血清IL-6水平檢測 采集受檢者肘靜脈空腹血5 mL以備測試。使用E.ZNA Blood DNA Kit(美國OMEGA公司提供)，將基因組DNA溶于TE溶液中備用。采用聚合酶鏈反應(PCR)，以基因組DNA為模板進行DNA擴增。PCR反應體系為50 μL，其中模板DNA 1 μL，2×GC PCR緩沖液25 μL，LA Taq酶0.5 μL，0.5 mmol/L三磷酸脫氧核苷dNTP 8 μL，100 pmol/μL上、下游引物各1 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性3 min后，92 ℃變形30 S，56 ℃退火30 S，72 ℃延伸30 S，32個循環后，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。上游引物為5’-GGAGACGCCTTGAAGTAACTGC-3’，下游引物為5’-GAGTTTCCTCTGACTCCATCGCAG-3’。PCR擴增產物上樣于1%瓊脂糖凝膠，100 V恒壓電泳40 min。將電泳后的凝膠放在紫外透視儀上觀察電泳條帶，若條帶清晰，無其他雜帶，說明PCR產物擴增成功。擴增產物的限制性酶：取擴增產物2 μL，緩沖液2 μL， MbiⅠ限制性內切酶2 μL，無菌去離子水14 μL，37 ℃水浴箱孵育3 h。酶切產物以聚丙烯酰胺凝膠-溴化乙錠進行鑒定，電泳結果應用自動凝膠成像及分析系統進行成像、分析。用夾心酶聯免疫吸附法測定血清IL-6水平。

1.3 統計學方法 用SAS統計軟件進行數據分析，計數資料使用卡方檢驗，計量資料使用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.13組臨床資料比較 3組性別構成、年齡、吸煙史、吸煙指數的分布比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。痰瘀阻肺型組和肺腎氣虛型組肺功能指標均明顯低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 3組臨床資料比較

注：①與對照組比較，P<0.05。

2.2 IL-6-572位點單核苷酸多態性的基因圖譜 根據限制性酶切片段大小判斷IL-6-572位點的3種基因型。IL-6-572 CC、GG、CG3種基因型分別對應1條(163 bp)、2條(101 bp、62 bp)、3條(163 bp、101 bp、62 bp)。見圖1。

1，3，4，5為CC基因型；2為GG基因型；6為CG基因型圖1 IL-6-572位點的基因圖譜

2.3 3組IL-6-572位點基因型構成比較 在IL-6-572位點上，3組間 CC、CG、GG基因型頻率分布比較差異無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

2.4 3組血清IL-6水平比較 痰瘀阻肺型組、肺腎氣虛型組、對照組血清IL-6水平分別為(6.04±0.19)pg/mL、(5.95±0.22)pg/mL、(3.86±0.72)pg/mL，痰瘀阻肺型組與肺腎氣虛型組均高于對照組(P均<0.05)。

表2 3組IL-6-572位點基因型構成情況 頻數

3 討 論

吸煙是慢性阻塞性肺疾病的主要危險因素,與氣道阻塞有明確的關系，但僅有15%的慢性重度吸煙者發展成為有癥狀的慢性阻塞性肺疾病患者，表明遺傳因素在慢性阻塞性肺疾病的發病中起著重要的作用。近年來通過研究發現某些證候與某些基因有一定關聯性，某些基因型可能是某些證候的易感因素。目前慢性阻塞性肺疾病中醫發病研究多采用辨病與辨證相結合的模式，但若在肺脹病證結合基礎上探討中醫證型與基因多態性的相關性，將更有利于中醫辨證分型客觀化，有利于進一步提高中醫辨證論治水平和臨床療效。痰瘀阻肺及肺腎氣虛是肺脹患者臨床常見證型，不同分型患者有不同臨床表現及治療側重點。

研究表明，IL-6具有促炎性細胞分化、趨化，并上調黏附分子和其他細胞因子的表達，增強炎癥反應效應[1]。 IL-6過度表達與慢性阻塞性肺疾病患者的呼吸困難[2]、骨骼肌乏力[3]、胰島素抵抗[4]、肺動脈高壓[5]、病情惡化[6]相關；在鼠類模型中發現過度表達IL-6可誘發肺氣腫和氣道炎癥[7]；即使在COPD穩定期，患者血CRP、纖維蛋白原、血小板和白細胞也比健康對照者偏高[8]，而IL-6能夠上調他們的表達。IL-6在患者血清、呼出冷凝物、痰液中的高表達能預測FEV1快速下降，并同患者體質量下降及肌肉廢用密切相關[9-10]；可以發現經吸入糖皮質激素有效治療后IL-6濃度下降[11]。這些提示IL-6與慢性阻塞性肺疾病的發病機制密切相關。Cordoba-Lanus等[12]研究認為IL-6-597G/A和IL-6-174G/C位點多態性與西班牙人慢性阻塞性肺疾病發病無關，IL-6-572C/G位點的C等位基因可以降低西班牙人發展為慢性阻塞性肺疾病的風險。本研究結果顯示，各組間 IL-6-572C/G 多態性比較差異無統計學意義，提示IL-6-572位點單核苷酸多態性可能與肺脹患者痰瘀阻肺型、肺腎氣虛型發病無明顯相關性。痰瘀阻肺型、肺腎氣虛型血清IL-6水平高于對照組，考慮可能慢性阻塞性肺疾病為全身炎癥反應性疾病，IL-6生成可能與其他炎癥因子參與調控有關。但是還需要更大樣本量的同類研究來提供進一步的證據。

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Analysis of correlation of IL-6 -572 single nueleotide polymorphism with lung distension of lung retention of phlegn and blood stasis type and lung-kidney Qi deficiency type

YANG Wenhao1, SHU Huimin2, LIU Fengge1

(1. The People’s Hospital of Hubei Medical College, Shiyan 442000, Hubei, China; 2. The First Hospital of Danjiangkou 442700, Hubei, China)

Objective It is to investigate the correlation of IL-6 -572 single nueleotide polymorphism (SNP) with lung distension of lung retention of phlegn and blood stasis type and lung-kidney Qi deficiency type． Methods 78 Han patients with lung distension of lung-kidney Qi deficiency type in Shiyan area were selected as lung-kidney Qi deficiency type group, 64 ones of lung retention of phlegn and blood stasis type as lung retention of phlegn and blood stasis type group, 182 healthy ones as control group. The SNP-572 in the IL-6 promoter gene were analyzed by using PCR-RFLP method，the concentrations of serum IL-6 were measured by using ELISA kit. Results There was no statistically differences in the distribution of genotype CC, CG, GG among the three groups (P>0.05). The levels of serum IL-6 in lung-kidney Qi deficiency type group and lung retention of phlegn and blood stasis type group were both higher than that in control group (P<0.05), but there was no significant difference in the level between lung-kidney Qi deficiency type group and lung retention of phlegn and blood stasis type group. Conclusion IL-6 572 SNP was not correlated with the pathogens of COPD patients of lung-kidney Qi deficiency type and lung retention of phlegn and blood stasis type.

chronic obstructive pulmonary disease; IL-6; single nueleotide polymorphism; lung-kidney Qi deficiency type; lung retention of phlegn and blood stasis type; lung distension

楊文昊，男，碩士研究生，主要從事中西醫結合防治呼吸系統疾病研究。

劉鳳閣，E-mail:syliufg@sina.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.25.007

R743.3

A

1008-8849(2015)25-2756-03

2015-03-10