鹽度漸變與驟變對脊尾白蝦滲透、代謝及免疫相關酶活力的影響

李玉全，李永生，趙法箴

1 青島農業大學海洋科學與工程學院， 青島 266109 2 中國水產科學研究院黃海水產研究所, 農業部海洋漁業可持續發展重點實驗室, 青島 266071

鹽度漸變與驟變對脊尾白蝦滲透、代謝及免疫相關酶活力的影響

李玉全1，*，李永生1，趙法箴2

1 青島農業大學海洋科學與工程學院， 青島 266109 2 中國水產科學研究院黃海水產研究所, 農業部海洋漁業可持續發展重點實驗室, 青島 266071

為探討鹽度變化對脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)滲透、代謝及免疫相關酶活力的影響，實驗設置了鹽度漸變和驟變兩個實驗。漸變實驗，設置5、10、15、20、25、30、33(CK)、40 和45 共9個鹽度梯度；驟變實驗，鹽度從33突變至0、5、15、25 和 45，檢測血清ATP酶(包括Na+/K+-ATP酶和總ATP酶)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)及超氧化物歧化酶(SOD)活力。結果表明，漸變情況下，鹽度為5時，ATP酶活力出現最高值，然后隨著鹽度的升高表現出先降低后升高的趨勢。總ATP酶活力在鹽度為15—30之間較穩定，并在此范圍內達到最低值。AKP和ACP活力幾乎不受鹽度漸變的影響。SOD活力隨鹽度的升高，先上升后下降，并在鹽度為33時達到最大值。驟變情況下，ATP酶活力隨時間波動較大，AKP和SOD隨時間波動較小，而ACP幾乎不受影響。結果說明，鹽度驟變對脊尾白蝦酶活力的影響較鹽度漸變明顯，ATPase和SOD活力更易隨鹽度而變化，代謝酶(AKP、ACP)受鹽度變化的影響較小，說明滲透調節和免疫相關酶活力對鹽度變化反應敏感，養殖過程中應盡量保持鹽度穩定。

脊尾白蝦;鹽度;酶活力

脊尾白蝦(ExopalaemonCarinicauda)是我國特有的重要經濟蝦類，廣泛分布于我國河口、淺海及近海區，以渤海和黃海海區分布最為廣泛。該蝦是我國傳統漁業物種，除直接銷售外，還可加工成蝦仁，被譽為“金鉤蝦米”，其卵還可制作成蝦子醬，是深受人們喜愛的美食。近年來對其生物學特性、繁育、養殖等各方面的研究日趨增多[1- 2]。

脊尾白蝦鹽度適應范圍很廣，可適應4—35變幅，最適鹽度22—28[11- 12]，馴化后甚至可以在純淡水中生長和繁殖[13]。蝦體生活在鹽度為4.5—35.5的海水(滲透壓114—1178 mOsm/kg)中，其血淋巴滲透壓587—797 mOsm/kg[14]，即當外界環境的滲透壓發生大幅變化時，機體血淋巴的滲透壓較為穩定。這說明，在半咸水條件下，脊尾白蝦可能采取高滲調節的方式維持滲壓平衡，而在真鹽水中則可能采取低滲調節維持滲壓平衡。無論是低滲調節和還是高滲調節都是伴隨水體鹽度變化而產生的，即在外界鹽度發生變化時脊尾白蝦機體會產生一系列調節適應，其中酶活力是重要的調節方式之一。然而，目前鹽度變化對脊尾白蝦相關酶活力的影響未見相關報道。本文擬探討鹽度漸變和驟變對脊尾白蝦相關酶的影響，實驗結果將有助于了解脊尾白蝦滲透、代謝以及免疫等調節的機理，從而為脊尾白蝦增養殖及資源保護提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗于青島農業大學海洋科學與工程學院水循環實驗室進行，所用脊尾白蝦購自青島市城陽水產零售市場，為膠州灣野生群體，原初水體鹽度31。選擇體色透明、健康活躍、無外傷、規格一致者作為實驗材料，實驗前暫養7 d。

1.2 實驗方法

實驗分鹽度漸變和驟變兩組進行。以自然海水為基礎，鹽度33、pH值8.3±0.2，水溫控制在(15±0.5)℃，用曝氣24 h的自來水和粗鹽調配實驗所需的低鹽或高鹽水。

1.2.1 漸變實驗

漸變實驗共設置9個鹽度梯度，分別為5、10、15、20、25、30、33、40和45。其中33為自然海水的鹽度。實驗中脊尾白蝦分為兩組，一組進行升鹽處理，每天升5個鹽度，升到鹽度分別為40或45時適應24 h，并隨機取45尾，放到對應鹽度的處理中進行實驗。另一組進行降鹽處理，鹽度降為15之前每天降5個鹽度，并在鹽度降為30、25、20、15時分別適應24 h，并隨機取45尾分別放入對應鹽度的處理中進行實驗。鹽度降為15后，每2d降5個鹽度，并在鹽度降為10、5時分別適應24 h，并隨機取45尾分別放入對應鹽度的處理中進行實驗。每天的鹽度升降分2次進行，采樣逐漸換水的方式，時間間隔為10—12 h。各鹽度梯度下養殖2周，隨機取蝦抽取血淋巴混合約1.0 mL置于1.5 mL 離心管中，4 ℃冰箱中過夜，5000 r/min離心10 min，取上清液放入-20 ℃冰箱中保存以備酶活測定用。

1.2.2 驟變實驗

驟變實驗共設置5個鹽度梯度，分別為0、5、15、25和45。從鹽度為33的暫養桶中分別隨機取45尾脊尾白蝦，放入對應鹽度的處理中進行實驗，并分別于放入蝦后1、6、12、18、24、36 h和48 h時隨機取5尾左右脊尾白蝦抽取血淋巴混合，4 ℃冰箱中過夜，5000 r/min離心10 min，取上清液放入-20 ℃冰箱中保存以備酶活測定用。

1.3 酶活力的測定

本實驗共測定4種相關酶的活力：ATPase(包括Na+/K+-ATPase和總ATPase(T-ATPase))、AKP、ACP和SOD。酶活力測定采用南京建成科技有限公司生產的相應酶試劑盒，按說明書描述的步驟進行。

1.4 數據處理與統計分析

實驗數據借助SPSS 13.0進行統計分析，利用單因素方差分析和LSD檢驗法統計分析差異性。借助EXCEL 2003進行作圖，所有數據用3個平行組數據的平均值±標準差來表示。

2 結果與分析

2.1 鹽度變化對ATPase活力的影響

由圖1可知，鹽度漸變對Na+/K+-ATPase和T-ATPase活力具有極顯著影響(P<0.01)。其中，鹽度從10漸變到5時，Na+/K+-ATPase活力升高了65%，T-ATPase活力升高了62%。這有可能說明Na+/K+-ATPase和T-ATPase在脊尾白蝦由低滲調節轉變為高滲調節時發揮重要作用。Na+/K+-ATPase活力在鹽度為10到45之間沒有顯著變化(P>0.05)，T-ATPase活力在10到33之間和40到45之間沒有顯著變化(P>0.05)，33到40之間上升了63%。Na+/K+-ATPase和T-ATPase活力隨鹽度變化的總體趨勢是先大幅度下降，鹽度為10到33之間相對平穩，鹽度大于30后又有所上升。

圖1 鹽度漸變對脊尾白蝦ATP(Adenosine triphosphate)酶活力的影響Fig.1 Effects of salinity gradient on ATPase activity of E. carinicauda 不同字母表示處理間差異顯著(P <0.05)

鹽度驟變實驗中，鹽度驟變為0處理的脊尾白蝦在1 h左右全部死亡；驟變為5處理的脊尾白蝦在 4—5 h內全部死亡；驟變為45處理的脊尾白蝦從17 h到48 h之間死亡較多。由圖2可知，鹽度從33驟變到45過程中，Na+/K+-ATPase和T-ATPase都具有極顯著的變化(P <0.01)。總體來看，Na+/K+-ATPase活力出現雙峰曲線變化，峰值分別出現在驟變后6h和36h，其中36h時出現最高值；T-ATPase活表現為單峰曲線變化，峰值出現在鹽度驟變后36h。

圖2 鹽度驟變對脊尾白蝦ATP酶活力的影響Fig.2 Effects of salinity abrupt on ATPase activity of E. carinicauda

2.2 鹽度變化對AKP活力的影響

由圖3可知，AKP活力受鹽度漸變的影響不顯著(P >0.05)，但隨著鹽度升高，AKP活力有升高的趨勢。而鹽度從33漸變到30或從33漸變到40時，AKP活力均有顯著變化(P<0.05)。

由圖4可知，鹽度驟變到25或45時，AKP活力變化極顯著(P<0.01)；驟變到25時AKP活力隨時間變化呈現出先上下波動后上升的趨勢；驟變到45時，AKP活力呈現先下降后上升的趨勢。

2.3 鹽度變化對ACP活力的影響

由圖5可知，漸變實驗中，ACP活力受海水鹽度變化的影響不顯著(P>0.05)。

由圖6可知，鹽度驟變到25或者45均對ACP活力有極顯著的影響(P<0.05)。總體來看，鹽度驟變到45時，隨著時間的變化，ACP活力呈先下降后上升的趨勢，并漸趨于穩定；驟變到25時，ACP活力則呈下降趨勢；驟變到15時，ACP活力略高于自然海水(33)，差異不顯著(P >0.05)。

圖3 鹽度漸變對脊尾白蝦堿性磷酸酶(AKP)活力的影響Fig.3 Effects of salinity gradient on AKP activity of E. carinicauda

圖4 鹽度驟變對脊尾白蝦AKP活力的影響Fig.4 Effects of salinity abrupt on AKP activity of E. carinicauda

圖5 鹽度漸變對脊尾白蝦酸性磷酸酶(ACP)活力的影響Fig.5 Effects of salinity gradient on ACP activity of E. carinicauda

圖6 鹽度驟變對脊尾白蝦ACP活力的影響Fig.6 Effects of salinity abrupt on ACP activity of E. carinicauda

圖7 鹽度漸變對脊尾白蝦SOD活力的影響Fig.7 Effects of salinity gradient on SOD activity of E. carinicauda

2.4 鹽度變化對SOD活力的影響

由圖7可知，SOD酶活力隨著鹽度的變化總體具有上升的趨勢，鹽度為33時出現最大值，但鹽度漸變對SOD酶活力的影響未達到顯著水平(P>0.05)。

由圖8可知，鹽度驟變到25或45時，SOD活力變化極顯著(P<0.01)。總體來看，驟變到25時，SOD活力先上升，達到漸變到該鹽度時的SOD活力水平時穩定下來；驟變到45時，SOD活力在24h內呈劇烈波動狀態，后趨于穩定。

圖8 鹽度驟變對脊尾白蝦SOD活力的影響 Fig.8 Effects of salinity abrupt on SOD activity of E. carinicauda

3 討論

3.1 鹽度變化對脊尾白蝦滲透相關酶的影響

水生生物在長期的進化過程中，已經逐漸適應外界環境中的鹽度變化。它們主要通過調控血淋巴的滲透壓維持內液的穩態，以保證機體正常的生命活動[15]。機體血淋巴中的鈉離子和氯離子是形成滲透壓的主要因子[16]，離子調控主要靠鰓上皮細胞膜上的離子轉運酶來實現，其中Na+/K+-ATPase是維持機體Na+、K+離子平衡的關鍵酶[17]。當鹽度發生變化時，Na+、K+離子滲透壓發生變化，為維持Na+、K+離子的平衡，機體需要Na+/K+-ATP來協助調節機體內部的Na+、K+離子濃度，并且，在高鹽和低鹽環境下，維持Na+、K+離子平衡所付出的Na+/K+-ATP會增加，因此，Na+/K+-ATPase活力會提高。本實驗還發現，鹽度在10—45范圍內時，Na+/K+-ATPase活力變化不顯著，說明此鹽度范圍內脊尾白蝦可以快速調節維持Na+、K+離子的平衡，而當鹽度低于10時，機體需付出大量的Na+/K+-ATP來維持平衡。而當鹽度驟變時，Na+/K+-ATPase活力會發生大幅度的波動，可能與機體的應激反應難以適應短時間大幅度的滲透壓變化有關。結合實驗過程中脊尾白蝦的成活率，發現當鹽度漸變降至10以下或升至40以上時會顯著降低其成活率，說明過高或過低鹽度脊尾白蝦短時間內很難適應。因此，在進行脊尾白蝦淡化養殖或高鹽養殖時當鹽度降至10或升至40時應放慢馴化速度，使其充分適應后再進行下一步鹽度馴化，具體馴化措施還需進一步探討。

另外，鹽度的變化還會引起活性氧分子大量生成，從而產生與之有關的應激反應[4]。這一過程會造成組織的氧化損傷以及機體的滲透失衡。機體需要消耗大量的ATP進行調節。當鹽度變化幅度過大時，機體調節平衡所消耗的ATP就會增多，當鹽度的變化超出機體自身的耐受范圍時，這種平衡往往會被打破[18]。本實驗證明，鹽度的漸變和驟變都會對脊尾白蝦的總ATPase活力產生極顯著的的影響，鹽度的驟變會使總ATPase活力大幅度波動，這可能是鹽度驟變導致ATP的異常消耗，這與前人的觀點一致[19]。

3.2 鹽度變化對脊尾白蝦代謝相關酶的影響

AKP和ACP在蛋白(酶)的去磷酸化過程中起著十分重要的作用。它們不僅參與一些營養物質的消化、吸收、運輸，而且還是生物體內重要的解毒體系[4]。因此，通過探討鹽度變對AKP和ACP活性的影響，有助于了解鹽度對機體的營養物質消化、吸收、運輸以及生物體內抗氧化系統的影響。王維娜等分析了鹽度等環境因子對日本沼蝦消化酶和堿性磷酸酶的影響[20]，劉存歧等分析了金屬離子對中國對蝦幼體體內堿性磷酸酶和ATPase的影響[21]，發現外界環境因子變化會影響磷酸酶的活力，認為磷酸酶活力的高低可作為判別環境因素是否適合對蝦生存的指標。本實驗證明，鹽度漸變對AKP和ACP活力均未產生顯著影響，但鹽度在30—40范圍內AKP活力產生顯著波動；鹽度驟變對AKP和ACP活力均產生了顯著影響。由此推斷，鹽度漸變對脊尾白蝦磷代謝相關酶活力影響較小，不會顯著影響機體的磷代謝，但鹽度驟變可能會對脊尾白蝦的磷代謝產生顯著影響。這與季延濱等在凡納濱對蝦上的研究結果相一致[22]。

3.3 鹽度變化對脊尾白蝦免疫相關酶的影響

有研究發現血液中SOD活性更為敏感，能更迅速的反應出環境中有害物質對機體的毒性作用[23]。本實驗發現，鹽度漸變，SOD活力變化活躍。當鹽度在20到33的范圍內時，SOD活力維持在較高水平，鹽度為33時出現最大值。換言之，鹽度的升高或者降低都會對SOD活力產生負面影響。因此，鹽度在20到33范圍內時，脊尾白蝦具有相對較高的免疫抵抗能力，鹽度過低或者過高都會影響其免疫活力。而鹽度驟變實驗表明，當鹽度發生驟變時，脊尾白蝦SOD活力都會在短時間內降低。隨著時間的增長，又會逐漸恢復到對應鹽度的水平。由此可知，鹽度發生驟變時會短時間內降低機體的免疫力，從而增大患病的幾率。這與前人在凡納濱對蝦上的研究結果相一致[22]。因此，養殖過程中維持鹽度的相對穩定是非常重要的。

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Effect of salinity changes on osmotic-, metabolic-, and immune-related enzyme activities inExopalaemoncarinicauda

LI Yuquan1，*, LI Yongsheng1, ZHAO Fazhen2

1CollegeofMarineScience&Engineering,QingdaoAgriculturalUniversity,Qingdao266109,China

2KeyLaboratoryofSustainableDevelopmentofMarineFisheries,MinistryofAgriculture,YellowSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Qingdao266071,China

Exopalaemoncarinicaudais an economically important shrimp species that is naturally distributed in the estuaries and coastal areas of China, especially in the Yellow Sea and the Bohai Sea, and contributes to one-third of the gross output of polyculture ponds in eastern China. Despite its economic importance, basic biological knowledge about this species remains limited. Salinity is one of the most important and changeable water quality factors affecting the physiology of aquatic organisms. Salinity variation may cause a variety of physiological responses, such as plasma enhanced stress-related hormones, stimulation of energy metabolism, and disruption of electrolyte equilibrium. Consequently, marine organisms have developed various survival mechanisms against salinity variation. For example, crustaceans adjust osmolarity and maintain an intra-corporal stable state by varying related enzyme activities.E.carinicaudalive in estuaries and coastal areas with highly variable salinity; yet, little is known about the osmotic adjustment mechanisms of this species. Enzyme activity regulation is one of the most important osmotic adjustment mechanisms. To investigate the effects of acute and gradual salinity changes on enzyme the enzyme activity ofE.carinicauda, two different experiments (acute change and gradual change) were performed. In the gradual change experiment, we used two different treatments. In the first treatment, the salinity was gradually raised from 33 to 40 and 45. In the second treatment, the salinity was gradually reduced from 33 to 5, 10, 15, 20, 25, and 30. For each salinity level, a group of 45 animals were randomly selected and cultured for two weeks. In the acute change experiment, five groups of 45 animals were randomly selected at 33 salinity, which was then abruptly changed to 0, 5, 15, 25, and 45. In each group, blood was collected from the animals for further enzyme activity analysis. ATPase (Na+/K+-ATPase and total ATPase), alkaline phosphatase (AKP), acidic phosphatase (ACP), and superoxide dismutase (SOD) activity was detected. In the gradual change experiment, maximum ATPase activity occurred at salinity 5. Interestingly, at the start of increasing salinity, ATPase activity rapidly decreased, but then increased with increasing salinity. Total ATPase activity was more stable in the range of salinity changes between 15 and 30, and reached a minimum level within this range. However, AKP and ACP activity was not significantly affected by gradual salinity changes. SOD activity initially increased, but then decreased with increasing salinity, with the maximum being detected at salinity 33. In the acute salinity changes experiment, ATPase activity fluctuated more intensely than AKP and SOD activity, while ACP activity was minimally affected. The results indicate that the effects of acute change on related enzyme activity were greater than those obtained through gradual change. ATPase and SOD activity was more vulnerable to salinity change than AKP and ACP activity. Overall, osmotic adjustment and immune related enzyme activity are very sensitive to salinity changes. These results are expected to help improve our understanding about the mechanisms of osmotic, metabolic, and immune regulation ofE.carinicaudaresponses to salinity changes. Which are expected to set a foundation for future breeding and resource protection for this species.

Exopalaemoncarinicauda; salinity; enzyme activity

國家自然科學基金項目(31101916)；山東省現代農業產業技術體系蝦蟹類創新團隊(SDAIT-15-011)；山東省自然科學基金項目(ZR2010CM060)；青島市科技成果轉化引導計劃(14-2-4-87-jch)

2014- 02- 10;

日期:2015- 04- 14

10.5846/stxb201402100226

*通訊作者Corresponding author.E-mail: jiangfangqian@163.com

李玉全，李永生，趙法箴.鹽度漸變與驟變對脊尾白蝦滲透、代謝及免疫相關酶活力的影響.生態學報,2015,35(21):7229- 7235.

Li Y Q, Li Y S, Zhao F Z.Effect of salinity changes on osmotic-, metabolic-, and immune-related enzyme activities inExopalaemoncarinicauda.Acta Ecologica Sinica,2015,35(21):7229- 7235.