非小細胞肺癌原發灶與轉移淋巴結組織CEA、ERCC-1表達及臨床意義

張文，顧劍玲，馮穎，王曉芳，李鵬

(1中國人民解放軍總醫院第一附屬醫院，北京100048；2天津市職業病防治院)

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非小細胞肺癌原發灶與轉移淋巴結組織CEA、ERCC-1表達及臨床意義

張文1，顧劍玲2，馮穎2，王曉芳2，李鵬2

(1中國人民解放軍總醫院第一附屬醫院，北京100048；2天津市職業病防治院)

摘要：目的比較非小細胞肺癌(NSCLC)原發灶與轉移淋巴結組織癌胚抗原(CEA)、切除修復交叉互補基因1(ERCC-1)表達的差異，并探討其意義。方法選擇NSCLC患者90例， TNM Ⅰ期19例、Ⅱ期26例、Ⅲ期29例、Ⅳ期16例。收集患者的原發灶及Ⅲ期患者的轉移淋巴結組織，檢測CEA、ERCC-1 mRNA及其蛋白表達。結果隨著TNM分期增高，NSCLC患者原發灶組織CEA、ERCC-1 mRNA及其蛋白表達逐漸升高(P均<0.05)。TNM Ⅲ期患者轉移淋巴結組織CEA、ERCC-1 mRNA及其蛋白表達高于原發灶組織(P均<0.05)。結論NSCLC原發灶組織CEA、ERCC-1表達隨TNM分期增高而升高，TNM Ⅲ期患者轉移淋巴結組織CEA、ERCC-1表達高于原發灶，CEA、ERCC-1高表達可能是肺癌發生淋巴結轉移的分子途徑。

關鍵詞：非小細胞肺癌；淋巴結轉移；癌胚抗原；切除修復交叉互補基因1

非小細胞肺癌(NSCLC)是肺癌最常見的病理類型，臨床主要采用手術切除、化療、生物靶向藥物等治療，但部分患者預后不佳，仍會出現遠處轉移[1]。部分NSCLC患者經化療、生物靶向藥物治療后，原發病灶縮小，但轉移灶可繼續增大，為NSCLC患者預后不佳的關鍵因素[2]。癌胚抗原(CEA)是目前應用最廣泛的腫瘤標記分子，而切除修復交叉互補基因1(ERCC-1)與NSCLC預后及化療耐藥等密切相關。本研究分析NSCLC原發灶與轉移淋巴結組織CEA、ERCC-1表達的差異，旨在探討NSCLC遠處轉移的分子機制，進而為臨床制定治療措施提供依據。

1資料與方法

1.1臨床資料選擇2012年5月～2014年6月天津市職業病防治院收治的NSCLC患者90例，均經組織病理學檢查明確診斷。排除標準：①術后病理診斷為小細胞肺癌者；②術前接受放、化療者；③合并呼吸衰竭、心功能不全及腎功能不全者。TNM Ⅰ期19例，男12例、女7例，年齡(62.12±6.54)歲，BMI(21.65±3.12)kg/m2，病理類型：腺癌8例、鱗癌6例、腺鱗癌3例、大細胞癌2例； Ⅱ期26例，男17例、女9例，年齡(61.85±6.42)歲，BMI(22.03±2.85)kg/m2，病理類型：腺癌12例、鱗癌7例、腺鱗癌5例、大細胞癌2例； Ⅲ期29例，男18例、女11例，年齡(61.77±6.35)歲，BMI(22.12±3.12)kg/m2，病理類型：腺癌12例、鱗癌11例、腺鱗癌4例、大細胞癌2例；Ⅳ期16例，男10例、女6例，年齡(62.18±6.42)歲，BMI(21.76±3.24)kg/m2，病理類型：腺癌7例、鱗癌6例、腺鱗癌2例、大細胞癌1例。各TNM分期患者性別、年齡、BMI、病理類型具有可比性。

1.2樣本采集TNM Ⅰ～Ⅲ期患者手術切除原發病灶，收集肺癌組織，Ⅳ期患者收集肺穿刺病灶組織，液氮迅速冷凍后-80 ℃保存；同時收集Ⅲ期患者轉移淋巴結活檢組織，用生理鹽水清洗，洗盡組織表面殘留血液后，用吸水紙吸盡組織水分，液氮迅速冷凍組織，-80 ℃保存。所有肺癌組織和轉移淋巴結組織均經病理檢查確認有癌細胞浸潤。

1.3原發灶及轉移淋巴結組織CEA、ERCC-1表達檢測

1.3.1CEA、ERCC-1 mRNA表達檢測引物設計與合成：參照高文斌等[3]的方法進行設計，包括上游與下游擴增引物序列與片段長度。CEA、ERCC-1 mRNA檢測：采用RT-PCR法。根據設計引物序列，TRIzol試劑抽提組織總RNA后，逆轉錄合成cRNA。逆轉錄反應體系20 μL，反應條件：42 ℃、30 min，95 ℃、2 min。得到cRNA標本后，按照合適比例稀釋樣本后進行PCR反應，反應條件：95 ℃變性25 s，56 ℃退火35 s，72 ℃復性65 s，共35個循環，最后72 ℃延伸5 min。收集PCR產物，進行2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外投射儀下得到DNA條帶，拍照記錄后輸入，對條帶的熒光度進行測定，計算CEA、ERCC-1 mRNA表達量。

1.3.2CEA、ERCC-1蛋白表達檢測參照試劑盒說明書提取總蛋白：原發灶和轉移淋巴結組織經生理鹽水沖洗2次后充分剪碎，加入蛋白裂解液14 000 r/min離心5 min，取上清5 μL加去離子水95 μL、考馬斯亮3 μL，于595 nm處測量OD值。蛋白電泳與轉膜：樣品(煮沸5 min、冷卻后取50 μg)、電泳(12%濃縮膠：90 V+30 min；10%分離膠：120 V+120 min)、轉膠(70 V+120 min)、脫脂漂洗(5%脫脂奶粉TBST溶液封閉抗體，TBS漂洗5 min×3次)。抗體孵育與染色：一抗孵育，4 ℃過夜；二抗孵育，37 ℃、1 h；曝光2 min，顯影后獲得CEA、ERCC-1對應的蛋白條帶，用軟件讀取蛋白條帶的灰度值，計算蛋白表達量[4]。

2結果

2.1不同TNM分期NSCLC患者原發灶組織CEA、ERCC-1表達比較見表1。

表1　不同TNM分期NSCLC患者原發灶組織CEA、ERCC-1表達比較

注：與Ⅰ期比較，*P<0.05；與Ⅱ期比較，#P<0.05；與Ⅲ期比較，△P<0.05。

2.2TNMⅢ期NSCLC患者原發灶與轉移淋巴結組織CEA、ERCC-1表達比較見表2。

表2　TNM Ⅲ期NSCLC患者肺癌原發灶與轉移淋巴結組織CEA、ERCC-1表達比較

注：與轉移淋巴結組織比較，*P<0.05。

3討論

NSCLC是肺癌最常見的病理類型，占所有肺癌的80%～90%[5]。隨著醫療水平的發展，NSCLC患者的預后得到極大改善[6]。含鉑類藥物的化療方案是治療NSCLC的標準方案，輔助以吉非替尼等生物靶向藥物或中醫藥物，可最大限度地殺滅腫瘤細胞、預防腫瘤復發，進而延長患者的生存時間[7]。但仍有部分患者在接受綜合治療措施后預后情況不佳，主要原因是綜合治療后發生遠處轉移[8]。研究發現，手術后化療或生物治療過程中原發腫瘤的生長雖然受到了明顯抑制，但轉移灶卻無明顯變化，甚至繼續增大。腫瘤原發灶和轉移灶對治療藥物敏感性不一致是影響治療效果和預后的主要因素。鑒于經淋巴結轉移是NSCLC最常見的轉移方式[9]，因此探尋原發灶及淋巴結轉移灶中差異表達的基因能夠為制定針對轉移病灶的治療方案提供參考和依據。

CEA是一類酸性糖蛋白，來自柱狀上皮細胞，是目前應用最廣泛的腫瘤標記分子[10]。正常成人血清中很難測出CEA，當氣道鱗狀上皮細胞發生癌變時會大量合成CEA，血清CEA水平與腫瘤直徑、是否轉移有一定相關性[6]，對于腫瘤術后復發的診斷敏感性達80%以上[11]。ERCC-1是由297個氨基酸組成的蛋白質，主要參與DNA雙鏈的切割以及損傷修復的過程[12]。由ERCC-1編碼產生的蛋白質能夠與DNA修復酶缺乏互補基因F(XPF)形成異源二聚體ERCC1-XPF，進而識別DNA的損傷片段并對5′末端進行切除[9]。研究表明，當ERCC1表達增強時，能夠使順鉑化療后產生的DNA絡合物被迅速清除，使停滯在G2/M期損傷的DNA迅速修復，進而導致順鉑耐藥[8]。因此，我們推測CEA、ERCC-1異常表達與肺癌的發生和病情的發展有關。

本研究結果顯示，隨著TNM分期升高，肺癌組織中CEA、ERCC-1表達越高，與朱建榮等[13]報道類似，表明CEA、ERCC-1過度表達與NSCLC的發生密切相關，CEA、ERCC-1表達越高，TNM分期越差。晚期肺癌患者遠處轉移的發生率較高，但造成癌細胞轉移的分子機制尚未闡明。本研究結果顯示，TNM Ⅲ期患者轉移淋巴結組織CEA、ERCC-1表達明顯高于原發灶組織，表明CEA、ERCC-1高表達與NSCLC淋巴結轉移密切相關。

綜上所述，NSCLC原發灶與轉移淋巴結組織中CEA、ERCC-1表達存在差異；CEA、ERCC-1高表達可能是NSCLL淋巴結轉移的潛在分子機制。本研究結果可為NSCLC的診治提供新思路。

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收稿日期：(2015-05-14)

中圖分類號：R734.2

文獻標志碼：B

文章編號：1002-266X(2015)48-0072-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.48.027

基金項目：吳階平醫學基金會資助項目(320.6750.12199)。