人感染高致病性禽流感病毒H5N1的病理學(xué)和病原學(xué)特點

劉相波

禽流感病毒屬于甲型流感病毒[1]。人感染禽流感是由禽流感病毒引起的人類疾病，根據(jù)禽流感病毒對雞和火雞的致病性不同，可將其分為低/非致病性、中、高三級[2]。由于禽流感病毒的血凝素結(jié)構(gòu)等特點，一般感染禽類，在病毒復(fù)制過程中，出現(xiàn)基因重配，導(dǎo)致病毒結(jié)構(gòu)出現(xiàn)改變，獲得感染人的能力，最終導(dǎo)致人感染禽流感疾病的發(fā)生[3]。近年來，禽流感不僅造成了人類的傷亡，同時還對家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了重創(chuàng)[4]。近年來先后在朝鮮、越南、泰國、韓國、日本、中國等10多個亞洲國家爆發(fā)H5N1高致病性禽流感病毒，引起全球的高度關(guān)注[5]。此次研究對在2008年1月-2014年1月中國內(nèi)地人禽流感患者25例進行研究，對其病理組織學(xué)、超微結(jié)構(gòu)及病因?qū)W特點進行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008年1月-2014年1月中國內(nèi)地人禽流感患者25例作為研究對象，其中男16例，女9例，年齡22~86歲，25例患者均符合《人感染禽流感診斷方案》中的標準，根據(jù)患者流行病學(xué)接觸史、臨床表現(xiàn)及實驗室檢查結(jié)果，可作出人感染H5N1禽流感診斷。流行病學(xué)史不詳?shù)幕颊撸鶕?jù)臨床表現(xiàn)、輔助檢查和實驗室檢測結(jié)果，從患者呼吸道分泌物標本中分離出禽流感病毒，或禽流感病毒核酸檢測為陽性，或動態(tài)檢測雙份血清禽流感病毒特異性抗體陽轉(zhuǎn)或呈4倍或以上升高[6]。

1.2 方法

1.2.1 胸腔局部解剖 對已死亡的1例患者進行胸腔局部解剖，摘除患者氣管、雙肺及心臟。

1.2.2 病理組織學(xué)制片與觀察 使用4%甲醛對標本進行固定，使用石蠟包埋，然后連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，然后在光學(xué)顯微鏡下對病理學(xué)組織進行觀察。

1.2.3 組織化學(xué)染色 Macchiavello病毒包含體染色和網(wǎng)織纖維染色。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色 采用單克隆抗體CK、CD68、CD20、CD8、CD4、CD3、S-100，EnVisionTM二步法染色，然后在光學(xué)顯微鏡下對其進行觀察。

1.2.5 電鏡制片與觀察 使用2.5%預(yù)冷戊二醛對組織標本進行固定，1%鋨酸后固定，使用樹脂包埋，然后將其超薄切片，使用乙酸鈾-檸檬酸鉛進行雙重染色，然后使用透射電鏡進行觀察。

1.2.6 病原體分離培養(yǎng)鑒定、全基因組序列測定及動物致病性觀察 細胞培養(yǎng)特性和培養(yǎng)細胞電鏡觀察；RT-PCR測定與部分基因序列分析；血清學(xué)試驗；全基因組序列測定和分析比較；新分離禽流感病毒動物致病性觀察。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察 對行胸部局部解剖的患者觀察發(fā)現(xiàn)，該名患者左側(cè)胸腔內(nèi)有黃色渾濁液體約400 mL，其左側(cè)胸腔內(nèi)有少量淡黃色液體，該名患者壁胸膜外觀呈現(xiàn)淡紅色。氣管黏膜充血，并且氣管腔內(nèi)有少量淡紅色分泌物。患者左肺上下葉外觀呈現(xiàn)出廣泛性實變狀，呈暗紅色，其切面有粉紅色泡沫狀液體流出；左肺呈現(xiàn)出淡粉紅色，散在斑片狀暗紅色區(qū)。心包內(nèi)存在少量的淡黃色液體。患者心臟外觀正常。

2.2 光鏡檢查

2.2.1 肺臟 左肺臟主要表現(xiàn)為廣泛性肺實變，顯著的肺水腫和肺出血及壞死。急性彌漫性肺泡損傷表現(xiàn)為肺泡上皮細胞增生，核增大，染色質(zhì)濃聚，部分肺泡上皮細胞可以看見核異型性及核分裂象。患者肺泡腔內(nèi)有大量的蛋白性滲出液，大量的淋巴細胞、巨噬細胞、紅細胞，少量的中性粒細胞及變性壞死脫落的肺泡上皮細胞以及多核或合體樣肺泡細胞，并且伴有明顯的透明膜形成；肺泡隔沒有明顯的增寬，有部分的小血管壁亦呈現(xiàn)纖維素性壞死，并且有少量的血栓形成。有部分區(qū)域的肺泡隔已經(jīng)出現(xiàn)較為嚴重的損毀及壞死，融合成片，并且伴有大量的中性粒細胞浸潤。左肺病變較重，又肺病變較輕，肺組織內(nèi)出血、充血呈灶狀或片狀分部。肺泡腔內(nèi)有大量的巨噬細胞、淋巴細胞、紅細胞及少量的水腫液、中性粒細胞等改變，有透明膜形成。支氣管：黏膜中可以看見有淋巴細胞核巨噬細胞浸潤；部分小支氣管出現(xiàn)壞死，并且充滿了炎性滲出物。

2.2.2 心臟 心包小血管充血。心肌間質(zhì)水腫，少量淋巴細胞浸潤。

2.3 免疫組織化學(xué)

2.3.1 肺臟 增生和脫落的肺泡上皮細胞及肺泡腔內(nèi)的合體和多核細胞均呈現(xiàn)CK陽性反應(yīng)。巨噬細胞呈現(xiàn)CD68陽性染色；只有少量的淋巴細胞CD3為陽性，標記B細胞的抗體CD79a及CD20均呈現(xiàn)陰性。SARS冠狀病毒S蛋白單克隆抗體染色呈陰性。

2.3.2 心臟 心肌間質(zhì)可以看見CD68陽性細胞浸潤，并且可看見有少量的CD3陽性淋巴細胞浸潤。

2.4 組織化學(xué)染色 （1）病毒包涵體染色：少量肺泡上皮細胞質(zhì)內(nèi)存在嗜酸性染色球形顆粒。（2）網(wǎng)織纖維染色：患者肺部壞死區(qū)域內(nèi)肺泡壁網(wǎng)織纖維出現(xiàn)斷裂，崩解消失。

2.5 電鏡檢查 Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮存在明顯的細胞腫脹，并且細胞表面微絨毛減少，肺泡表面活性物質(zhì)膜消失，并且能夠觀察到細胞凋亡和壞死。Ⅱ型肺泡細胞核體積增大，胞質(zhì)內(nèi)空泡形成，能夠看見線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹擴張。胞質(zhì)內(nèi)板層小體及早期病例相比數(shù)量增加。肺泡間隔內(nèi)血管內(nèi)皮紅細胞出現(xiàn)腫脹及空泡變性，肺泡間隔和肺泡腔內(nèi)可看見巨噬細胞、中性粒細胞、紅細胞和脫落的上皮細胞。在肺泡Ⅱ型上皮細胞及血管內(nèi)皮細胞可以看到A型流行性感冒病毒樣顆粒，多數(shù)呈現(xiàn)出球形，有囊膜，大小約為80~120 nm，高電子密度核心居中的C型病毒顆粒數(shù)量較多，低電子密度核心的A型病毒顆粒數(shù)量較少。

2.6 病原體分離培養(yǎng)鑒定

2.6.1 病原體的分離培養(yǎng) 將血漿標本接種Vero細胞16 h，觀察到細胞出現(xiàn)病變，24 h后，CPE達到4+。經(jīng)0.2 μm孔徑的濾膜過濾后分別接種Vero細胞，出現(xiàn)CPE，與未經(jīng)過過濾的樣品無差別。除Vero細胞外，接種MDCK細胞，在MDCK細胞進行試驗時出現(xiàn)病變時間相對于Vero細胞較早。2.6.2 培養(yǎng)細胞電鏡形態(tài)學(xué)觀察 在細胞外能夠看到大量的病毒顆粒，并且有明顯的突起，細胞內(nèi)可見少量的病毒。

2.6.3 RT-PCR測定 RT-PCR測定與部分基因序列分析均擴增出A型流感病毒的部分M和HA基因片段。擴增測序的M基因片段核苷酸序列與禽流感病毒的同源性為96%。HA基因片段核苷酸序列與禽流感病毒的同源性為97%。

2.6.4 血清學(xué)試驗 抗禽流感病毒特異血清H5N1、H9N1、N7N7特異血清。采用酶標抗體染色法、間接免疫熒光染色、血凝抑制試驗。使用雞抗禽流感病毒H5、H7、H9特異抗體進行酶標染色，然后分離病毒與雞抗禽流感病毒H5N1亞型特異抗體均呈現(xiàn)出陽性反應(yīng)。免疫酶標染色、血凝抑制試驗均與H5N1亞型特異抗體呈現(xiàn)出強陽性反應(yīng)。與SARS的特異抗體的反應(yīng)均呈現(xiàn)出陰性。

3 討論

人禽流行性感冒是由A型禽流感病毒的某些亞型毒株所造成的患者出現(xiàn)急性呼吸道傳染病，患者病死率較高，并且尚無有效的治療[7-8]。目前對有關(guān)人禽流感病原學(xué)、流行病學(xué)及其檢測的研究已經(jīng)有了進展，但關(guān)于人禽流感的發(fā)生及發(fā)展的病理過程及臨床特點還沒有定論，需要進一步的探索[9-10]。

此次研究使用電鏡、光鏡、免疫組織化學(xué)、組織化學(xué)方法對25例患者臨床表現(xiàn)為多器官衰竭和急性呼吸窘迫的高致病性禽流感病毒H5N1亞型感染病例進行觀察和研究，從而研究人感染高致病性禽流感病毒H5N1的病理學(xué)和病原學(xué)特點。

人感染禽流感病毒后，病毒在體內(nèi)的潛伏期約為1周，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱>39 ℃、氣促、呼吸困難、呼吸窘迫等；部分患者會出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、惡心等表現(xiàn)；癥狀較為嚴重的患者肺部病變發(fā)展較為快速，出現(xiàn)大片實變陰影，呈重癥急性肺炎改變，可能會出現(xiàn)急性呼吸窘迫、胸腔積液、多器官功能衰竭、肺出血等癥狀，患者病死率較高[11-12]。

綜上所述，高致病性A型禽流感病毒會導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴重急性病毒性肺炎，肺水腫、肺實變、明顯的出血性壞死性炎癥等病理改變?yōu)槠渲饕卣鳌ｋ婄R檢查可見A型禽流感病毒樣顆粒。研究人禽流行性感冒的病原學(xué)和病理學(xué)特點，為將來的人禽流感臨床診斷和治療方案提供了理論基礎(chǔ)和病理學(xué)基礎(chǔ)。

[1]蔡孟華，李錚，董鵬，等.高致病性禽流感病毒H5N1血凝素蛋白中和抗體及表位的鑒定[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2014，34（5）：633-637.

[2]彭海燕，遲瑩，李燕，等.高致病性禽流感病毒H5N1亞型核蛋白NP真核表達載體的構(gòu)建、表達與鑒定[J].江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué)，2014，25（5）：6-9.

[3]楊敏，成凌志，王偉.湘潭市高危場所環(huán)境中高致病性禽流感病毒（H5N1）的監(jiān)測結(jié)果分析[J].實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2014，21（3）：366-368.

[4]曹志亮.高致病性禽流感病毒H5N1中和抗體表位及機制研究[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2012.

[5]吳瑞平.高致病禽流感病毒H5N1中和抗體表位的研究[D].溫州：溫州醫(yī)學(xué)院，2013.

[6]莊麗，蒙黎明，趙文榮，等.貴州省2012年度禽流感病毒H5N1亞型HA-1基因分析[J].貴州醫(yī)藥，2013，37（6）：492-494.

[7]單云峰，李燕，遲瑩，等.H5N1亞型禽流感病毒聚合酶酸性蛋白真核表達載體的構(gòu)建與表達[J].江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué)，2014，25（3）：1-3.

[8]冼盈，朱翔，張永標，等.不同H5N1亞型高致病性禽流感病毒誘導(dǎo)IFN-α/β和MxA mRNA表達[J].中國病理生理雜志，2012，28（4）：708-713.

[9]呂星，王曉輝，吳春利，等.H5N1亞型禽流感病毒誘導(dǎo)的機體免疫損傷分析[J].中國人獸共患病學(xué)報，2013，29（7）：697-699.

[10]張立霞，于在江，周劍芳，等.H5N1禽流感病毒headless HA基因在桿狀病毒中的表達[J].中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志，2012，26（3）：179-181.

[11]劉麗琦，余慧燕，于在江，等.H5N1禽流感病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶基因在桿狀病毒中的共表達[J].實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2014，21（5）：543-546.

[12]孫麗娟，張雪梅，夏咸柱，等.H5N1禽流感病毒感染豚鼠體內(nèi)MAVS基因表達情況研究[A].2013中國生物制品年會暨第十三次全國生物制品學(xué)術(shù)研討會論文集[C]，上海，2013.