HPLC同步檢測(cè)精神病患者血漿中氟西汀及氯氮平藥物濃度

孫蔚華吳蓉李寧張國(guó)華

（1贛州市第三人民醫(yī)院，江西贛州341000；2南昌市第二醫(yī)院，南昌330003；3江西省科學(xué)院生物資源研究所，南昌330029）

HPLC同步檢測(cè)精神病患者血漿中氟西汀及氯氮平藥物濃度

孫蔚華1吳蓉2李寧1張國(guó)華3

（1贛州市第三人民醫(yī)院，江西贛州341000；2南昌市第二醫(yī)院，南昌330003；3江西省科學(xué)院生物資源研究所，南昌330029）

目的：建立一種簡(jiǎn)單、快速的同步測(cè)定氟西汀和氯氮平血藥濃度的高效液相色譜方法。方法：以氯丙咪嗪為內(nèi)標(biāo)，樣品用含2%異丙醇的正庚烷提取凈化，以C18柱作為分析柱，流動(dòng)相為甲醇-磷酸氫二銨緩沖液（70∶30），pH 6.5，流速為1.0 m L/min，柱溫為40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。結(jié)果：氟西汀和氯氮平的線性范圍為50～1 500μg/L，線性關(guān)系良好，分析方法的檢測(cè)限為10.0μg/L。低、中、高濃度的回收率、穩(wěn)定性及精密度均符合方法學(xué)要求。結(jié)論：該方法精密、簡(jiǎn)便、快速，可用于臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)和藥代動(dòng)力學(xué)研究。

氟西汀；氯氮平；血藥濃度；高效液相色譜法

氯氮平為一種非典型的抗精神病藥物，因其較少引起錐體外系反應(yīng)，為臨床所常用[1]。精神病患者除患有精神分裂外常伴有抑郁癥狀。氟西汀作為5-羥色胺（5-HT）再攝取抑制劑類(lèi)抗抑郁藥，可選擇性地抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT的再攝取，延長(zhǎng)和增加5-HT的作用，從而產(chǎn)生抗抑郁作用[2]。因此，在臨床上常采用氯氮平與氟西汀聯(lián)合用藥治療精神分裂癥患者。由于氯氮平與氟西汀的治療窗相對(duì)較窄,使得其在臨床上的使用劑量受到限制，對(duì)其進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)，具有一定的臨床意義[3]。目前，精神疾病藥物測(cè)定方法主要有氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜質(zhì)譜法（GC/MS）等，但是國(guó)內(nèi)沒(méi)有同步測(cè)定血漿中氯氮平與氟西汀濃度的文獻(xiàn)報(bào)道[4]。本文利用HPLC建立同步測(cè)定血漿中氯氮平與氟西汀濃度的方法，并在臨床上應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀系統(tǒng)（Waters 1525泵、Waters 2487紫外可見(jiàn)光光度檢測(cè)器、Empower色譜工作站）；高速低溫離心機(jī)；低溫冰箱；分析天平；渦旋器；容量瓶；離心管。

1.2 藥品與試劑

氟西汀對(duì)照品（Sigma，含量>99%）；氯氮平對(duì)照品（Sigma，含量＞99%）；內(nèi)標(biāo)氯丙咪嗪（上海醫(yī)藥工業(yè)研究院）；甲醇（色譜純）；磷酸、磷酸氫二銨、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、乙醇、異丙醇、正庚烷均為分析純（其中異丙醇、正庚烷經(jīng)重蒸處理）；水為重蒸水。

1.3 對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)溶液配置

氯氮平標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：精密稱(chēng)取氯氮平10.000 mg，置于10 m L容量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解至刻度，搖勻，精密吸取1.0 m L于100 m L容量瓶中，用50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻備用，終濃度為10μg/m L。

氟西汀標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：精密稱(chēng)取氟西汀10.000 mg，置于10 m L容量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解至刻度，搖勻，精密吸取1.0 m L于100 m L容量瓶中，用50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻備用，終濃度為10μg/m L。

內(nèi)標(biāo)氯丙咪嗪溶液配制：精密稱(chēng)取氯丙咪嗪10.000 mg，置于10 m L容量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解至刻度，搖勻，精密吸取1.0 m L于100 m L容量瓶中，用50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻備用，終濃度為10μg/m L。

上述溶液均密閉避光－18℃保存。

1.4 色譜條件[5]

色譜柱為Nova Pak C18柱（150 mm×3.9 mm；4μm），流動(dòng)相為甲醇-磷酸氫二銨緩沖液（70∶30），pH 6.5，流速1.0 m L/m in，柱溫40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，進(jìn)樣量10μL。

1.5 血漿樣品預(yù)處理[6]

取－20℃冷凍保存的血漿樣品，自然融化，混勻后取1.0 m L，加入10μL內(nèi)標(biāo)氯丙咪嗪溶液和500μL 1 mol/L NaOH溶液，混勻，加入2%異丙醇的正庚烷提取液5 m L，于旋渦混合器上混合30 s，然后于高速低溫離心機(jī)以3 500 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min（10℃），吸取上層提取液，加入0.1 mol/L磷酸二氫鉀溶液（磷酸調(diào)pH至5.0）100μL，于旋渦混合器上混合2 min，3 500 r/min轉(zhuǎn)速離心5 m in棄去上層有機(jī)溶液，吸取下層溶液10μL進(jìn)樣。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[7]

取6支10 m L編號(hào)具塞離心管，分別加入10μg/m L氯氮平標(biāo)溶液和10μg/m L氟西汀標(biāo)溶液5，10，20，50，80，100μL，吹干，加入內(nèi)標(biāo)氯丙咪嗪溶液10μL，再分別加入健康人空白血漿各1 m L，按血漿樣品預(yù)處理方法處理后，進(jìn)樣分析。1.7臨床檢測(cè)[8]

隨機(jī)選擇23名同時(shí)患有精神分裂和抑郁癥的精神病患者，于每日上午同時(shí)服用治療藥物鹽酸氟西汀20 mg和氯氮平300 mg。告知23名患者監(jiān)護(hù)人，于2，4，6周患者再次服藥前抽取患者血樣進(jìn)行血藥含量測(cè)定，以確保合理用藥達(dá)到治療效果。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

經(jīng)HPLC檢測(cè)分析，測(cè)定得到一組氯氮平及氟西汀濃度與相對(duì)應(yīng)的氯氮平及氟西汀和氯丙咪嗪峰高比值的數(shù)據(jù)，結(jié)果見(jiàn)表1。使用SPSS軟件進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，氯氮平：

Y=0.021 5X－0.014 7，

r=0.996 2；氟西汀：

Y=0.012 4X－0.013 7，

r=0.998 6。當(dāng)信躁比：S/N=3時(shí)，兩者檢測(cè)限達(dá)10.0μg/L。

表1 氯氮平和氟西汀血漿濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

空白血漿、氯氮平、氟西汀及內(nèi)標(biāo)氯丙咪嗪的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 空白血漿，氯氮平，氟西汀及內(nèi)標(biāo)氯丙咪嗪的色譜

由圖1可知，血清中內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)氯氮平及氟西汀的測(cè)定無(wú)干擾，氯氮平和氟西汀均能達(dá)到基線分析，氟西汀的tR=6.865 m in，氯氮平的tR= 8.990 m in，內(nèi)標(biāo)氯丙咪嗪tR=12.498 m in，色譜分析20 m in內(nèi)完成。

2.2 精密度和回收率試驗(yàn)

按照“1.5”中方法精密配制含氯氮平和氟西汀50.0，500.0，1 500.0μg/L低、中、高3種血藥濃度的樣品，按“1.6”方法測(cè)定，每份樣品重復(fù)測(cè)定5次，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得精密度，并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 測(cè)定氯氮平及氟西汀的精密度和回收率

2.3 干擾試驗(yàn)

在同一色譜條件下，對(duì)常用及可能伍用藥物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)考察，結(jié)果顯示常用配伍藥物對(duì)氯氮平和氟西汀的測(cè)定沒(méi)有干擾，見(jiàn)表3。

表3 常見(jiàn)精神病藥物的保留時(shí)間

2.4 臨床檢測(cè)結(jié)果

抽取服藥患者靜脈血液按照“1.6”方法測(cè)定，測(cè)得患者血藥濃度結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

治療藥物監(jiān)測(cè)是臨床藥理學(xué)重要的研究?jī)?nèi)容，主要通過(guò)靈敏的現(xiàn)代分析測(cè)試手段定量分析患者血液樣本中的藥物及其代謝產(chǎn)物的濃度，探討血藥濃度與藥物療效、毒性之間的關(guān)系，以確定藥物有效濃度及毒性濃度之間的范圍，并可根據(jù)藥物動(dòng)力學(xué)公式來(lái)計(jì)算最佳的治療劑量，做到用藥個(gè)體化,指導(dǎo)臨床合理用藥[9]。

表4 患者服用氯氮平和氟西汀后的血藥濃度 （ng/m L）

氟西汀因毒副作用少，對(duì)中、重度抑郁癥患者有較好的療效，是較理想的抗抑郁藥物，因其治療窗相對(duì)較窄，其血藥濃度的監(jiān)測(cè)對(duì)于避免毒性反應(yīng)、分析療效不佳原因、調(diào)整藥物劑量、預(yù)測(cè)臨床療效等有一定的臨床意義。氯氮平臨床常用于治療精神分裂癥，尤其對(duì)難治性精神分裂癥的療效較好,但其體內(nèi)吸收迅速，當(dāng)血藥濃度超過(guò)一定濃度范圍時(shí)，如中性粒細(xì)胞減少等副作用明顯增加。因此，氯氮平血藥濃度監(jiān)測(cè)對(duì)避免或減少毒副反應(yīng)、指導(dǎo)合理用藥具有重要意義。精神病藥物阿米替林、多塞平、氯丙嗪、利培酮及9-羥利培酮等的藥效關(guān)系及治療窗已經(jīng)確立，并在臨床中進(jìn)行藥物監(jiān)測(cè)。氟西汀和氯氮平在臨床治療精神分裂癥患者常聯(lián)合用藥，其血藥濃度與臨床效應(yīng)相關(guān)，對(duì)其進(jìn)行藥物監(jiān)測(cè)對(duì)于提高療效和減少副反應(yīng)有重要意義，也應(yīng)在臨床中推薦使用。此方法在我院經(jīng)歷了一年多的臨床應(yīng)用，當(dāng)測(cè)得患者血藥濃度低于或者超出治療藥物濃度時(shí)，告知臨床醫(yī)生改變用藥策略，使得藥物血藥濃度回歸到藥物濃度治療窗范圍，實(shí)踐證明本文提供的方法可行。

論文對(duì)流動(dòng)相的組成及其比例、pH等進(jìn)行了研究，確定了流動(dòng)相在pH 6.5左右分離效果較好。流動(dòng)相主要為甲醇、水，價(jià)廉，低毒。由于甲醇黏度較大，適當(dāng)提高柱溫，能有效地降低柱壓。選擇230 nm波長(zhǎng)的紫外光能同時(shí)檢測(cè)氟西汀和氯氮平的濃度，并能消除內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。

[1] 石向群，李紅，李衛(wèi)東.氯氮平治療精神分裂的血藥濃度及臨床療效及不良反應(yīng)的關(guān)系[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2007，17（6）：728-730.

[2]王立偉，王志陽(yáng)，諸索宇，等.加用氟西汀對(duì)氯氮平療效及血濃度的影響[J].上海精神醫(yī)學(xué)，2000，12（2）：66-68.

[3] 任顯峰，鄭素娟，馬召紅.氯氮平合并氟西汀治療慢性精神分裂癥陰性癥狀的對(duì)照研究[J].中國(guó)民康醫(yī)學(xué)雜志，2004，16（7）：391-393.

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Synchronous Determ ination of Serum Drug Concentration of Fluoxetine and Clozapine in Psychiatric Patient by HPLC

Sun Weihua1，Wu Rong2，Li Ning1，Zhang Guohua3（1 The Third People’s Hospital of Ganzhou City，Jiangxi Ganzhou 341000，China；2 The Second Hospital of Nanchang City，Nanchang 330003；3 Institute of Biological Resources of Jiangxi Academy of Science，Nanchang 330029）

Objective:To develop a simple and rapid method for synchronous determination of serum drug concentration of fluoxetine and clozapine in psychiatric patient by HPLC.M ethods:Chloride imipramine was used as a internal standard，serum samples were extracted by n-heptane containing 2%isopropyl alcohol，the C18analytical column was adopted w ith themobile phase ofmethanol sodium phosphate dibasic buffer solution（70∶30），the pH was 6.5，the flow rate was 1.0 m L/m in，the column temperature was at 40℃and the detective UV wavelength was at 230 nm.Results:The linearity was obtained w ithin the range of 50～1 500μg/L of both fluoxetine and clozapine，which was good in linear relationship.The minimal quantification lim it was 10.0μg/L. The recovery，stability and precision of serum drug concentrations at low，m iddle and high levels were all in line w ith the requirements of the methodology.Conclusion:This method is simple，precise and rapid，it can be used for monitoring serum drug concentration in clinical practice and pharmacokinetic study.

Fluoxetine；Clozapine；Serum Drug Concentration；HPLC

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.01.005

2014-10-09）

孫蔚華，男，主管藥師。研究方向：臨床藥學(xué)。E-mail：654135377@qq.com