丹參酮ⅡA對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬效應(yīng)蛋白Beclin1表達(dá)的影響

郝國(guó)強(qiáng)，邢壯杰，鄭　新，李潤(rùn)生，趙　暉，鄧芝徽

(大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院普外一科，遼寧 大連　116001)

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丹參酮ⅡA對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬效應(yīng)蛋白Beclin1表達(dá)的影響

郝國(guó)強(qiáng)，邢壯杰，鄭新，李潤(rùn)生，趙暉，鄧芝徽

(大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院普外一科，遼寧 大連116001)

摘要：目的氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-densitylipoprotein，ox-LDL)可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生自噬，造成血管內(nèi)皮損傷，從而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。該研究擬探討丹參酮ⅡA對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬效應(yīng)蛋白Beclin1表達(dá)的影響。方法(1)運(yùn)用不同濃度ox-LDL處理人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs，MDC染色、流式細(xì)胞儀檢測(cè)ox-LDL對(duì)HUVECs自噬水平的影響，采用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)自噬標(biāo)記蛋白Beclin1表達(dá)；(2)ox-LDL處理后，運(yùn)用不同濃度丹參酮ⅡA干預(yù)，MDC染色、流式細(xì)胞儀HUVECs自噬水平變化，免疫印跡檢測(cè)Beclin1蛋白水平變化。結(jié)果ox-LDL能誘導(dǎo)HUVECs發(fā)生自噬，丹參酮ⅡA能抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs自噬效應(yīng)蛋白Beclin1表達(dá)。結(jié)論丹參酮ⅡA通過(guò)抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs自噬，從而對(duì)ox-LDL所致的HUVECs損傷起保護(hù)作用。

關(guān)健詞：丹參酮ⅡA；ox-LDL；自噬；Beclin1

隨著社會(huì)發(fā)展和人民生活水平的提高，心腦血管疾病已經(jīng)成為威脅人民健康的重要疾病，而導(dǎo)致心腦血管疾病的最重要原因即動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)。動(dòng)脈粥樣硬化均是在脂質(zhì)代謝異常、血流動(dòng)力學(xué)損傷、遺傳、感染、物理化學(xué)等多種損傷刺激下啟動(dòng)的發(fā)病過(guò)程。自噬(autophagy)是一種由氧化應(yīng)激、損傷等誘發(fā)的非凋亡性、程序性細(xì)胞死亡方式(programed cell death，PCD)，在AS性心血管疾病中起著重要作用[1-2]。研究表明動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)可以引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬，從而造成血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[3]。而內(nèi)皮細(xì)胞的損傷與AS的發(fā)病存在密切關(guān)系，由于內(nèi)皮細(xì)胞層的破壞，誘發(fā)了血中脂質(zhì)沉積、平滑肌細(xì)胞遷移、斑塊形成等繼發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化病理過(guò)程，最終導(dǎo)致動(dòng)脈腔的狹窄甚至閉塞。丹參是臨床最為常用的活血祛瘀藥物之一，廣泛應(yīng)用于動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病即血瘀證的治療，具有良好的療效[4]。丹參酮ⅡA為丹參提取的菲醌類衍生物中的一種,是臨床上治療心血管疾病的主要藥物。本研究對(duì)丹參有效成分丹參酮ⅡA對(duì)ox-LDL引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬進(jìn)行研究。

1材料和方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)及處理

1.1.1細(xì)胞培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞購(gòu)自上海，用DMEM培養(yǎng)液、10%FBS 培養(yǎng)，置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用 0.25%胰酶+EDTA消化成單個(gè)細(xì)胞后傳代。

1.1.2 細(xì)胞處理細(xì)胞傳代貼壁后，分為空白細(xì)胞組、陽(yáng)性對(duì)照組(Bredeldin A處理)、ox-LDL處理組(25、50、75、100 mg·L-1)和ox-LDL加丹參酮ⅡA(0、0.5、1.0、1.5 mg·L-1)處理組，作用24 h收集細(xì)胞，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2試劑單丹磺酰戊二胺(Monodansylcadaverine，MDC)購(gòu)自Sigma公司，鼠抗人β-actin抗體、兔抗人Beclin1抗體購(gòu)自Abcam公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自GE公司，胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司，丹參酮ⅡA(Tanshinone ⅡA)購(gòu)自北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 MDC染色檢測(cè)細(xì)胞自噬0.125%胰酶消化貼壁的血管內(nèi)皮細(xì)胞，PBS洗滌 3 次，1 000 r·min-1離心5 min收集細(xì)胞，用含 50 μmol·L-1MDC的DMEM懸浮細(xì)胞，37℃避光孵育1 h；4%多聚甲醛37℃避光固定 30 min；PBS洗滌3次，500 μL PBS懸浮細(xì)胞；流式細(xì)胞儀分析。

1.4Western檢測(cè)自噬相關(guān)基因各組細(xì)胞用PBS清洗3次，加入適量裂解液，冰上放置裂解20 min；充分吹打并轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中于4℃下×12 000 g離心5 min，將上清分裝轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中，-80℃保存。根據(jù)蛋白定量的結(jié)果，取40 μg 蛋白樣品經(jīng)丙烯酰胺凝膠(4%濃縮膠、10%分離膠)80 V電壓下電泳，電轉(zhuǎn)膜。加入含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1～2 h。分別加入相應(yīng)一抗體4℃冰箱孵育過(guò)夜。用 TBST洗膜10 min×3 次，加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，與ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色1～2 min，暗室曝光X膠片，用Gel-Pro analyzer軟件掃描定量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0軟件進(jìn)行處理；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較用單因素方差分析；組間兩兩比較為 LSD 檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1ox-LDL對(duì)HUVECs自噬水平的影響通過(guò)MDC染色、流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果顯示ox-LDL可以誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞自噬，隨著ox-LDL濃度的增加， HUVECs細(xì)胞自噬水平相應(yīng)增加，25、50、75、100 mg·L-1ox-LDL作用24 h后，MDC陽(yáng)性細(xì)胞率分別為18.6%、25.3%、30.3%、41.2%，與對(duì)照組 (4.8%)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.2ox-LDL對(duì)HUVECs自噬基因Beclin1表達(dá)的影響免疫印跡結(jié)果顯示，ox-LDL作用于HUVECs 24 h后，Beclin1(P=0.005)蛋白表達(dá)明顯增加；且隨著ox-LDL濃度的增加Beclin1蛋白表達(dá)量也明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.3丹參酮ⅡA對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs自噬水平的影響取ox-LDL 100 mg·L-1作用于HUVECs 細(xì)胞，同時(shí)分別加入丹參酮ⅡA(0、0.5、1.0、1.5 mg·L-1)，作用24 h后進(jìn)行MDC染色，檢測(cè)HUVECs 細(xì)胞自噬水平。結(jié)果顯示，隨著丹參酮ⅡA濃度的增加，ox-LDL 100 mg·L-1誘導(dǎo)的HUVECs 細(xì)胞自噬水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3，P<0.05)。表明丹參酮ⅡA對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs自噬有一定的抑制作用。

2.4丹參酮ⅡA對(duì)HUVECs自噬基因表達(dá)的影響取ox-LDL 100 mg·L-1作用于HUVECs 細(xì)胞，同時(shí)分別加入丹參酮ⅡA(0、0.5、1.0、1.5 mg·L-1)，作用24 h后進(jìn)行MDC染色，檢測(cè)HUVECs 細(xì)胞自噬水平。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，加入丹參酮ⅡA后Beclin1蛋白表達(dá)水平明顯降低，隨著丹參酮ⅡA濃度的增加， Beclin1蛋白的降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4，P<0.05)。表明丹參酮ⅡA對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的自噬效應(yīng)蛋白Beclin1表達(dá)有一定的抑制作用。

3討論

自噬(autophagy)是由氧化應(yīng)激、損傷等誘發(fā)的非凋亡性、程序性細(xì)胞死亡方式，是一種通過(guò)溶酶體清除細(xì)胞內(nèi)已衰老或過(guò)剩的生物大分子(如蛋白質(zhì))和細(xì)胞器的分解代謝途徑，是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和存活的重要機(jī)制之一[5]。Beclin1是酵母自噬基因Atg6/Vps30的同系物[6-7]，在自噬過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。典型的自噬過(guò)程是，首先Beclin1與待降解物周?chē)纬傻耐淌膳?phagophore)膜相結(jié)合，隨后Atg12-Atg5和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, MAP1LC3)會(huì)被有序地募集到吞噬泡膜上，吞噬泡膜逐步延伸形成自噬體(autophagosome)。被募集的MAP1LC3-I會(huì)與膜上的磷脂酰乙醇胺共價(jià)結(jié)合形成LC3-Ⅱ。在自噬體完全形成后，除了部分與自噬體膜腔面結(jié)合的MAP1LC3-Ⅱ外，大部分的Atg蛋白會(huì)被回收至胞漿中。最后，自噬體與溶酶體融合，形成了自噬性溶酶體(autophagolysosome)，由此降解MAP1LC3-Ⅱ和被包入其中的物質(zhì)[8-9]。

研究表明自噬在心血管疾病中起著重要作用[10]，ox-LDL可以引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬。Nowicki等[11]的研究表明，在EA.hy926細(xì)胞[人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC和A549細(xì)胞融合細(xì)胞，該細(xì)胞仍保持HUVEC的成血管功能)]系中，加入ox-LDL后利用透射電鏡可觀察到雙層膜自噬體的形成，并通過(guò)Western印跡檢測(cè)到自噬標(biāo)記物L(fēng)C3-Ⅱ含量的增加，在用100 mg·L-1的ox-LDL處理32 h之后，細(xì)胞會(huì)發(fā)生過(guò)度自噬而死亡。Zhang等[12]研究表明，在HUVEC細(xì)胞中，ox-LDL能夠通過(guò)LC3/Becline1信號(hào)途徑，誘導(dǎo)自噬小體和溶酶體融合形成自噬溶酶體，促進(jìn)自噬的發(fā)生，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL在HUVEC中的降解途徑有兩種：一是在泛素蛋白酶體中被降解，二是在自噬溶酶體內(nèi)被降解。因此，自噬的增強(qiáng)能促進(jìn)ox-LDL的降解。Muller等[13]研究也表明，動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)性因素高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)可以抑制ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，這也從另一方面說(shuō)明了ox-LDL誘導(dǎo)的自噬在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)ox-LDL可以誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞自噬水平的升高，而自噬效應(yīng)蛋白Beclin1蛋白表達(dá)量也隨ox-LDL濃度的增加而增加，這與他人的研究結(jié)果一致。

丹參是臨床最為常用的活血祛瘀藥物之一，復(fù)方丹參滴丸、丹參飲、活絡(luò)效靈丹等許多方劑都以丹參為主要組成藥物，廣泛應(yīng)用于動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病即血瘀證的治療，且具有良好的療效。丹參酮ⅡA是丹參的有效成分之一，其作用機(jī)制涉及多方面，如改善心功能、影響血小板功能、改善血液流變性、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、影響AS相關(guān)基因表達(dá)等。同時(shí)丹參酮ⅡA是丹參中活性較強(qiáng)的成分，可直接保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，增加內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量并改善其功能，從而具有促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)和冠脈側(cè)支循環(huán)的形成。關(guān)于其作用機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮Ⅱ A 能下調(diào)培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子VCAM-1 和細(xì)胞間黏附分子 ICAM-1 表達(dá) ，阻滯血管平滑肌細(xì)胞 VSMC 通過(guò)細(xì)胞周期的限制點(diǎn)，使其停滯于 G0/G1期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及影響細(xì)胞骨架微絲結(jié)構(gòu)等，從而抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。另高劑量丹參酮ⅡA能夠顯著抑制細(xì)胞上清液中淋巴細(xì)胞刺激因子 IL-1β 的表達(dá)，亦可干預(yù)脂多糖激活炎癥信號(hào)通道中相關(guān)環(huán)節(jié)，抑制蛋白 IκB 與核轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB 靶分子的高效表達(dá)，從而通過(guò)抑制 AS時(shí)炎癥介質(zhì)的表達(dá)達(dá)到防治 AS 的目的。王維蓉等[14]發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA能抑制H2O2引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞減少，還能抑制過(guò)氧化氫損傷的內(nèi)皮細(xì)胞釋放MDA和LDH。石紅等[15]的研究也表明經(jīng)丹參酮ⅡA能逆轉(zhuǎn)馬兜鈴酸誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率，促進(jìn)抗凋亡蛋白bcl-2的表達(dá)、抑制促凋亡蛋白bax的表達(dá)和下調(diào)caspase-3活性。Tang等[16]的研究則表明丹參酮ⅡA能通過(guò)抑制內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶-1的合成從而抑制TNF-αB誘導(dǎo)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷時(shí)內(nèi)皮素的生成。諸多的研究已經(jīng)證明丹參酮ⅡA對(duì)心血管疾病有著重要的應(yīng)用前景[17]。我們研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬有一定的抑制作用，可以抑制自噬效應(yīng)蛋白Beclin1的表達(dá)，這一結(jié)果為丹參酮ⅡA在心血管疾病中的作用提供了一種新的可能的解釋。

自噬對(duì)ox-LDL的降解作用在動(dòng)脈粥樣硬化早期可能起著保護(hù)作用，但長(zhǎng)期、高濃度的ox-LDL作用則會(huì)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)度自噬而引起血管內(nèi)皮的損傷，而丹參及其有效成分可以通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞起到保護(hù)作用。其分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)研究證明。

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基金項(xiàng)目:大連市醫(yī)學(xué)衛(wèi)生科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(No 2014-92)

通信作者：邢壯杰，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：血管外科基礎(chǔ)與臨床，E-mail:xzhj1218@163.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.12.045

(收稿日期：2015-07-29，修回日期：2015-08-20)

Effect of Tanshinone ⅡA on the expression of autophagy
protein Beclin1 of vascular endothelial cell induced by ox-LDL

HAO Guo-qiang, XING Zhuang-jie, ZHENG Xin, et al

(FirstDepartmentofGeneralSurgery,AffiliatedZhongshanHospitalofDalianUniversity,

Dalian,Liaoning116001,China)

Abstract:Objective Oxidized low-densitylipoprotein(ox-LDL) can induce the autophagy of vascular endothelial cell and cause damage to it, which results in atherosclerosis. This study is to explore the effect of Tanshinone ⅡA on the expression of autophagy protein Beclin1 of vascular endothelial cell induced by ox-LDL.Methods We used different densities of ox-LDL to deal with the human umbilical vein vascular endothelial cells(HUVECs), then used the MDC staining,flow cytometry(FLM) to detect the effect of ox-LDL on autophagy level of HUVECs and used western blot to detect the expression of autophagy protein Beclin1.After the induction of ox-LDL,different densities of Tanshinone ⅡA were used to intervene, then the MDC staining ,flow cytometry(FLM) were used to detect the change in autophagy level of HUVECs and western blot was used to detect the expression of autophagy protein Beclin1.Results Ox-LDL could induce the autophagy of HUVECs and Tanshinone ⅡA could inhibit the expression of autophagy protein Beclin1 of HUVECs induced by ox-LDL. Conclusion Tanshinone ⅡA has a protective effect on the damage to HUVECs caused by ox-LDL by inhibiting the autophagy of HUVECs induced by ox-LDL.

Key words:tanshinone ⅡA;ox-LDL;autophagy; Beclin1