黃芩湯抗TNBS誘導的小鼠潰瘍性結腸炎活性研究

巢　蕾，曹雨誕，陳佩東

(1.江蘇省中醫院藥劑科,江蘇 南京　210029;2.南京中醫藥大學藥學院,江蘇 南京　210046)

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黃芩湯抗TNBS誘導的小鼠潰瘍性結腸炎活性研究

巢蕾1，曹雨誕2，陳佩東2

(1.江蘇省中醫院藥劑科,江蘇 南京210029;2.南京中醫藥大學藥學院,江蘇 南京210046)

摘要：目的 研究黃芩湯水煎液中主要成分及對2,4,6-三硝基苯磺酸鈉 (TNBS)造模balb/c小鼠的潰瘍性結腸炎的作用。方法HPLC-MS法分析水煎液成分。雄性balb/c 小鼠隨機分為空白對照組，TNBS模型組，柳氮磺嘧啶陽性對照組(500 mg·kg-1)，黃芩湯水煎液1，2，4 g·kg-1治療組。TNBS造模7 d后，研究各組小鼠的結腸病理評分、微觀評分、體質量、小鼠結腸長度和血清髓過氧化物酶(MPO)。結果與標準品對照，黃芩湯水煎液中含有復方中主要成分，黃芩湯水煎液可使TNBS造模balb/c小鼠的體質量明顯增加，改善身體的一般狀況和小鼠結腸黏膜的損傷，下調MPO。結論黃芩湯水煎液中含有各藥物的主要成分，對TNBS誘導的小鼠潰瘍性結腸炎具有較好的治療作用。

關鍵詞：潰瘍性結腸炎;黃芩湯;髓過氧化物酶;液質聯用;2,4,6-三硝基苯磺酸鈉

潰瘍性結腸炎(UC)是一種常見的非透壁性腸道炎癥[1]，盡管目前其確切的發病機制尚不清楚，但一般認為是由于腸道細菌過度活躍引發的黏膜免疫反應所引起的疾病[2]。黃芩湯由黃芩、炙甘草、白芍和大棗組成，臨床主要治療腹瀉、嘔吐、惡心等腸道疾病，對抗癌藥物引起的腸黏膜損傷具有修復作用[3]。黃芩湯中各藥物主要含有黃酮類[4-5]、皂苷類[6]、單萜苷類[7]和三萜類[8]等成分，并且具有抗炎和調節免疫作用[9-12]。近年對黃芩湯的抗潰瘍性結腸作用研究有一定進展[13-14]，但對黃芩湯作用的機制及物質基礎研究尚不明確。本實驗對黃芩湯水煎液的化學成分進行了液質聯用分析，并對其抗2,4,6-三硝基苯磺酸鈉(TNBS)誘導的小鼠急性潰瘍性結腸炎的活性進行了研究，為進一步研究提供了依據。

1材料

1.1藥物和試劑黃芩湯由黃芩、白芍、炙甘草和大棗組成，分別購自內蒙古(No.121201)、安徽(No.120809)、山東和河北(No.121126)，由南京中醫藥大學中藥鑒定教研室吳德康教授鑒定為黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)、白芍(PaeonialactifloraPall)、炙甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)和大棗(ZiziphusjujubeMill.)。芍藥苷、黃芩苷、齊墩果酸、烏蘇酸、甘草酸購自中國藥品鑒定所，氧化芍藥苷、羥基芍藥苷、白樺脂酸、甘草次酸、甘草查爾酮A、甘草苷、異麥角甾苷、白楊素購自成都曼思特公司，漢黃芩素、千層紙素A、黃芩素分離自本實驗室。 TNBS購自sigma公司，柳氮磺嘧啶(SASP)，上海三維公司，批號20130514，戊巴比妥鈉，髓過氧化物酶(MPO)試劑盒,南京建成公司,批號20140110。

1.2實驗動物雄性balb/c小鼠(20～24 g)，購自青龍山動物中心，動物許可證號SCIXK(蘇) 2012 -0004。

1.3實驗儀器1290液相色譜系統，6460三重四級桿質譜系統(安捷倫)，數據采集和處理應用MassHunter 工作站軟件 (Version B.03.00)完成 。

2方法

2.1黃芩湯水煎液的制備黃芩300 g，白芍200 g和炙甘草200 g，大棗300 g[3]，以8倍量水煎煮3次， 每次1 h。所得浸膏得率為32.6%，分別配制成1、2、4 g·kg-1給藥劑量。

2.2HPLC-MS分析條件液相色譜條件為Kromasil C18(250 mm×6 mm,5 μm)色譜柱，柱溫 30℃，流動相 A 為0.05%甲酸 ，B為乙腈，梯度洗脫(0～10 min, 85%～80% A; 10～35 min, 80%～75% A;35～55 min, 75%～70% A;55～65 min, 70%～60% A;65～90 min,60%～35%A;90～92.5 min,35%～5% A;92.5～102.5 min,5%A;102.5～110 min,5%～85%A;110～115 min, 85%A)；體積流量0.6 mL·min-1，進樣3 μL，檢測波長254 nm。質譜條件為電噴霧離子源，負離子模式掃描；干燥氣溫度350℃，干燥氣流量10 L·min-1，離子源溫度320℃，霧化氣電壓40 psi(1 psi=6.895×103Pa)，毛細管電壓3 500 V。

2.3動物分組與給藥小鼠飼養溫度22～24℃，隨機分為6組 (n=10)，分別為空白對照組，陽性對照組，TNBS模型組。給藥組為黃芩湯水煎液1、2、4 g·kg-1劑量組。小鼠禁食24 h后，以戊巴比妥鈉50 mg·kg-1麻醉，通過0.56 mm PE管將三硝基苯磺酸鈉100 mg·kg-1注入小鼠結腸4 cm處造模。50%TNBS試劑0.1 mL 緩慢注入小鼠結腸，空白組注入50%乙醇。然后將小鼠垂直倒立，保持2～3 min，放回鼠籠[15]。空白對照組及模型組以羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)給藥，陽性對照組以柳氮磺嘧啶(500 mg·kg-1)給藥，給藥組為黃芩湯水煎液1、2、4 g·kg-1，持續7 d。

2.4樣品采集造模7 d后，小鼠眼眶取血，然后處死。將小鼠腹膜剪開，取距肛門2 cm以上3～5 cm處結腸，以PBS液反復清洗，置于濾紙上吸干水分。取相同位置結腸，在10%福爾馬林中固定24 h，用于病理切片。所取血液放置5 min后，3 000 r·min-1離心,取出血清后置于PE管，-80℃保存。

2.5結腸病理和組織學評價根據TNBS誘導的炎癥損傷進行結腸病理評價：0級，沒有損傷;1級，水腫，沒有潰瘍；2級，輕微潰瘍，沒有明顯炎癥；3級，潰瘍伴有1處炎癥；4級，2處或以上炎癥伴有潰瘍面積小于1 cm；5級，2處以上嚴重潰瘍或大于1 cm炎癥區域。結腸組織以4%多聚甲醛固定，脫水，隨后嵌入石蠟，進行HE染色組織學評價：0級，正常結腸;1級，黏膜炎癥；2級，炎癥病灶于黏膜表層或下層；3級，病灶于肌層；4級，病灶位于絨毛膜；5級，嚴重潰瘍和炎癥[15]。

2.6髓過氧物酶評價小鼠血清MPO活力以spectrophotometer (Bio-Bad, USA)測定，波長460 nm ，按試劑盒標準程序進行測定[16-17]。

3結果

3.1黃芩湯水煎液HPLC-MS分析黃芩湯水煎液總離子流圖見圖1，其中A為混和對照品，B為黃芩湯水煎液。從分析結果可以看出，黃芩湯樣品中含有包括黃芩中的黃芩苷等主要黃酮類成分，白芍中的芍藥苷等單萜苷類成分，炙甘草中的甘草酸等三萜及黃酮類成分及大棗中的白樺脂酸等三萜類成分。

A混合對照品B黃芩水煎液樣品

圖1黃芩湯水煎液總離子流圖

注：1.氧化芍藥苷；2.羥基芍藥苷；3.芍藥苷；4.異麥角甾苷；5.甘草苷；6.麥角甾苷；7.黃芩苷；8.甘草素；9.黃芩素；10.甘草酸；11.千層紙素A；12.白楊素；13.漢黃芩素；14.甘草查爾酮A；15.甘草次酸；16.烏蘇酸；17.白樺脂酸；18.齊墩果酸。

表1　黃芩湯對TNBS造模小鼠結腸病理評分、體質量、結腸和MPO的影響

注：與對照組比較*P<0.05，△P<0.01；與模型組比較#P<0.05，▲P<0.01。

3.2病理學觀察及損傷評分造模后，各組的體質量變化、結腸長度、宏觀損傷評分和MPO結果見表1。

小鼠經TNBS造模后出現皮毛疏散、進食減少、懶動、腹瀉和便血等癥狀。小鼠體質量下降明顯，結腸部位表現出不同程度的紅腫和潰瘍。具體數據見表1。由此可以看出，模型組小鼠的結腸長度為(5.98±0.30)cm，而體質量下降(-19.23 ±2.15)%，與對照組比較明顯下降。結腸病理評分和血清MPO活力則顯著上升，與對照組比較均有顯著性差異，表明造模成功。經過柳氮磺嘧啶和黃芩湯治療后，結腸長度和體質量增長明顯，而結腸病理評分和MPO活力則顯著下降，與模型組相比較均有顯著性差異，表明對潰瘍性結腸炎有治療作用，且黃芩湯三個劑量組呈現一定的量效關系。

3.3組織學評價對造模小鼠結腸組織的HE染色組織學評價發現，陽性對照組有黏膜的輕微浸潤，空白組有正常上皮的黏膜，模型組顯示了黏膜有炎性浸潤并且伴有嚴重的結構扭曲，竇炎和隱窩膿腫，藥物治療組表明局部灶腺腔有凋亡細胞，但比模型組有較大改善,見圖2。

4討論

黃芩湯中主要成分具有抗炎、調節免疫作用。應用三硝基苯磺酸鈉法制備的UC大鼠模型是探討UC發病的免疫學機制和研究開發UC新藥的一個理想模型，本實驗選擇TNBS模型造模。

通過HPLC-MS可以看出，黃芩湯水煎液中保留了各藥物中主要活性成分，其中黃芩中的黃芩苷、白芍中的芍藥苷、甘草中的甘草酸和大棗中的三萜苷元白樺脂酸等都存在于水煎液中。這些成分都具有調節免疫和抗菌、抗炎的作用,其中的黃芩苷、甘草酸等也是黃芩湯血清中的主要成分[18]。

造模后小鼠的結腸明顯縮短，體質量下降明顯，有便血、懶動等癥狀，而MPO活力顯著增加是體內炎癥的重要表現[19]。陽性對照組和各給藥組與模型組相比，結腸長度顯著增加，體質量恢復明顯，MPO活力下降，結腸損傷恢復。本實驗結果表明，黃芩湯水煎液對潰瘍性結腸炎具有較好的治療作用，且呈現一定量效關系。

目前，全球治療潰瘍性結腸炎的藥物有100余種，而正在研究的藥物多達近80種，包括水楊酸類藥物如美沙拉嗪，腫瘤壞死因子拮抗劑如戈利木單抗，免疫抑制劑如芬戈莫德、山喜多 ，干細胞療法藥物如remestemcel-I，但這些藥物停藥后容易復發，長期應用副作用大。黃芩湯出自《傷寒論》，是“醫圣”張仲景傳世的“經方”之一，本實驗研究了黃芩湯水煎液所含成分及其抗潰瘍性結腸炎作用，為進一步研究其作用機制提供了依據。

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doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.12.012

基金項目：南京中醫藥大學風險基金(No CX201202)

通信作者：陳佩東，男，博士，副教授，研究方向：中藥化學及活性成分研究, E-mail:chenpeidong1970 @163.com

(收稿日期:2015-08-20,修回日期:2015-09-04)

Effect of huangqin decoction on TNBS induced ulcerative colitis in mice

CHAO Lei1,CAO Yu-dan2, CHEN Pei-dong2

(1.JiangsuHospitalofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210029,China;

2.NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210046,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the main constituents and the effects of Huangqin decoction on 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) induced colitis in mice. Methods The decoction was analyzed by HPLC-MS, and the animals were randomly divided into 6 groups(n=10):normal control, TNBS control, positive control(500 mg·kg-1) and Huangqin decoction groups with 1,2,4 g·kg-1respectively. 7 days after the induction of colitis with TNBS, the effects were studied by pathological score, histological analysis, body loss, colon length as well as by determination of MPO.Results The decoction had the main compounds of the plants. After the treatment with the decoction, the body weight and colon length were increased, the microscopic and macroscopic score were lowered, and the level of serum MPO activity was markedly decreased. Conclusion Hangqin decoction has the main constituents from various plants, and is effective in the treatment of colitis induced by TNBS.

Key words：ulcerative colitis；huangqin decoction;MPO;HPLC/MS;2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid